摘  要：本研究通過高效液相色譜-串聯質譜法(High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS)建立了豬肉中氟苯尼考殘留物殘留量的檢測方法，檢測限和定量限分別為5 μg/kg和10 μg/kg。在10 μg/kg～4 000 μg/kg濃度范圍內，空白豬肉樣品的標準曲線線性關系良好，相關系數均在0.99以上。氟苯尼考和氟苯尼考胺的添加濃度在10 μg/kg、500 μg/kg和2 000 μg/kg時，回收率均大于85％，批間和批內變異系數均小于5％。該方法適用于豬可食性組織中氟苯尼考殘留量的測定。關鍵詞：氟苯尼考；殘留量；豬；檢測氟苯尼考是一種動物專用的半合成酰胺醇類抗生素，有眾多的優點，抗菌譜廣，動物體內分布廣泛，注射或內服均吸收良好，既無潛在致再生障礙性貧血作用，也無致畸、致癌或致突變作用。氟苯尼考能有效治療由巴氏桿菌和睡眠嗜組織菌引起的牛呼吸道系統疾病，可用于防控豬胸膜肺炎放線桿菌、鏈球菌和巴氏桿菌引起的豬呼吸道疾病，也可有效治療魚類的細菌感染，因此在畜禽養殖中的使用日益頻繁。隨著氟苯尼考的廣泛使用，動物源性食品中氟苯尼考殘留問題也引起消費者的擔憂，加強氟苯尼考殘留監控需建立特異性高、靈敏度好的檢測方法。目前，針對氟苯尼考殘留量檢測方法包括微生物法、酶聯免疫吸附法、高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯質譜法(High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS)和氣相色譜法。其中微生物法的靈敏度和特異性較差，且操作煩瑣；酶聯免疫吸附法操作簡單，但靈敏度較差；高效液相色譜法準確性高，特異性好，但靈敏度同樣較差；HPLC-MS/MS準確性高，靈敏度高，特異性好，雖然對儀器設備要求較高，但是極高的靈敏度更適合監控食品中的氟苯尼考殘留[1-3]。本研究通過分析比較氟苯尼考檢測方法，優化前處理以及色譜條件，建立了一種準確性高、靈敏度高、重復性好的檢測豬可食性組織中氟苯尼考殘留量的液相色譜-串聯質譜法。1  試驗材料1.1 藥品與試劑氟苯尼考和氟苯尼考胺對照品：含量均為99.5％，購自中國獸醫藥品監察所。乙腈、甲醇和甲酸為色譜純，乙酸乙酯、正己烷、氨水、乙酸銨為分析純。1.2 儀器設備 液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀(HPLC-MS/MS)[賽默飛世爾科技(中國)有限公司，型號Thermo Scientific TSQ Endura]。1.3 標準儲備液氟苯尼考儲備液：準確稱取10 mg氟苯尼考于50 mL容量瓶，乙腈定溶，配制成200 μg/mL氟苯尼考標準儲備液。氟苯尼考胺儲備液：準確稱取10 mg氟苯尼考胺于50 mL容量瓶，甲醇定溶，配制成200 μg/mL氟苯尼考標準儲備液。1.4 混合標準工作液分別量取適量200 μg/mL氟苯尼考和氟苯尼考胺的混合標準儲備液，用乙腈稀釋，制成5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL、2 000 ng/mL和4 000 ng/mL的混合標準溶液，現配現用。1.5 其他溶液配制3％氨水-乙酸乙酯溶液：準確量取    30 mL氨水，加入970 mL乙酸乙酯混勻即可。2  方法2.1 制備試樣取均質后的空白豬肉樣品，作為空白試料；取均質后的空白豬肉樣品，添加適宜濃度的標準溶液，作為空白添加試料。2.2 樣品處理準確稱取攪碎后的豬肉樣品5.00 g (±0.05 g)，裝入50 mL聚丙烯離心管中，加入20 mL 3％氨水-乙酸乙酯液，渦旋混勻5 min，在10 ℃下10 000 r/min離心10 min，將上清液轉移到另一50 mL聚丙烯離心管中。下層殘渣再用20 mL的3％氨水-乙酸乙酯液提取一次，合并以上兩次上清液，備用。移取以上備用液5 mL，50 ℃氮氣吹干。殘渣用2 mL流動相復溶，加入5 mL正己烷漩渦混勻30 s，然后以5 000 r/min離心10 min，收集下層水相，再用5 mL正己烷重復凈化一次，最后用0.22 µm的無機濾膜過濾水相，濾液用(HPLC-MS/MS)檢測。2.3 基質標準曲線的繪制吸取適量系列混合標準工作液，加入“2.2 樣品處理”所述殘渣復溶后的空白溶液，制備空白基質溶液，使其進樣終濃度為5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL、2 000 ng/mL、4 000 ng/mL，進行液相色譜-串聯質譜測定，以特征離子質量色譜峰面積為縱坐標，以對應的基質標準溶液濃度為橫坐標，繪制基質標準曲線，計算標準曲線回歸方程以及相關系數。2.4 儀器條件色譜柱：安捷倫科技有限公司的Agilent Zebox C18 色譜柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)，流動相A為0.1％氨水，流動相B為乙腈，流速300 μL/min，進樣量25 μL，柱溫40 ℃。液相洗脫梯度：0 min～1 min維持85％ A；1 min～2 min線性變化至15％ A；2 min～3 min維持15％ A；3 min～4 min線性變化至85％ A；4 min～5 min 維持85％ A。電離源：電噴霧離子源，采用正/負離子混合模式；掃描方式為選擇反應監測(SRM)模式；傳輸毛細管溫度350 ℃；干燥氣溫度300 ℃；鞘氣壓力310.26 kpa；輔助氣流速12 L/min；Ion Sweep氣體壓力13.79 kPa；電子倍增器電壓3 700(+)/3 500(-) v；碰撞氣為高純氬氣(純度為99.99％)；離子源選擇電噴霧離子源(ESI)。氟苯尼考胺選擇248.1/229.9(定量離子)，碰撞能量10，248.1/130.1(定性離子)，碰撞能量20；氟苯尼考選擇，－355.9/－335.9(定量離子)，碰撞能量13，－355.9/－184.9(定性離子)，碰撞能量19。2.5 檢測限(LOD)和定量限(LOQ)的確定5個空白豬肉平行樣品，按照“2.2 樣品處理”所述方法前處理后上儀器檢測，測得基線噪音，將信噪比≥3時的濃度定為檢測限，信噪比≥10時的濃度為定量限。2.6 準確性準確性用添加樣品回收率表示，于 50 mL聚丙烯的離心管中稱取3份5.00 g(±0.05 g)均質好的空白豬肉樣品，每份樣品分別加入1 000 ng/mL、50 000 ng/mL、200 000 ng/mL的混合標準工作液0.1 mL，使混合標準工作液在各樣品中的濃度分別為20 ng/g、40 ng/g和1 000 ng/g。通過“2.2 樣品處理”所述方法前處理后，上機檢測的各樣品最終上機濃度為10 ng/g、500 ng/g、2 000 ng/g，進樣體積為25 μL，HPLC-MS/MS測定定量離子峰面積，同時用HPLC-MS/MS測定對應濃度的混合標準工作液(10 ng/g、500 ng/g、2 000 ng/mL)的定量離子峰面積。各個濃度分別重復5次，回收率的計算公式如下： 式中：A為預處理后組織中氟苯尼考、氟苯尼考胺的實測定量離子峰面積；AS為對應濃度的混合標準液中氟苯尼考、氟苯尼考胺的定量離子峰面積。2.7 精密度精密度以空白豬肉添加樣品測定的日間變異系數和日內變異系數表示。稱取3份    5.00 g(±0.05 g)均質的空白豬肉樣品，裝入50 mL聚丙烯離心管，分別加入1 000 ng/mL、50 000 ng/mL、200 000 ng/mL混合標準工作液0.1 mL，使混標在各組織中的濃度分別為20 ng/g、1 000 ng/g和4 000 ng/g。按“2.2 樣品處理”所述的方法處理，上機檢測的各組織最終濃度為10 ng/g、500 ng/g、  2 000 ng/g，取25 μL濾液進行HPLC-MS/MS測定，同時用25 μL對應濃度的混合標準工作液(10 ng/mL、500 ng/mL、2 000 ng/mL)，進行HPLC-MS/MS測定。各濃度樣品同一天內重復測定5次，HPLC-MS/MS測得氟苯尼考、氟苯尼考胺定量離子峰面積，用標準曲線回歸方程計算各樣品藥物濃度，求出日內變異系數。一周內5 d分別檢測三個濃度樣品，每個樣品重復測定5次，HPLC-MS/MS測得氟苯尼考、氟苯尼考胺定量離子峰面積，用標準曲線回歸方程計算各樣品藥物濃度，求出日間變異系數。3  結果3.1 基質標準曲線、檢測限(LOD)和定量限(LOQ)在以上質譜條件下，氟苯尼考和氟苯尼考胺標準工作液(藥物濃度在10 μg/kg～4 000 μg/kg范圍內)各個濃度與其峰面積成良好的線性關系(R2≥0.99)，方法的檢測限(LOD)和定量限(LOQ)分別為5 μg/kg和10 μg/kg。氟苯尼考回歸方程為Y＝9 816.3x＋301 250，R2＝0.998；氟苯尼考胺回歸方程為Y＝67 312x－403 487，R2＝0.999。3.2 添加回收率與精密度對10 ng/mL、500 ng/mL、2 000 ng/mL三個樣品添加濃度進行回收率測定，添加回收率與精密度結果見表1和表2。4  討論4.1 氟苯尼考殘留量檢測氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺的提取方法有許多，提取試劑通常為乙酸乙酯、乙腈、甲醇和丙酮等。比較不同的提取試劑對回收率的影響，甲醇和乙腈提取率較差，回收率較低；氟苯尼考胺為弱堿性物質，用乙酸乙酯提取時加入適量氨水。提取效果更佳，回收率也更高。相對于用丙酮或二氯甲烷提取，用乙酸乙酯加氨水混合后提取，帶入的干擾物質較少，可以進一步簡化凈化過程，無須固相萃取小柱的凈化，極大節約了樣品前處理的成本，故本試驗選擇乙酸乙酯氨水混合溶液為提取試劑。用強陽離子交換固相萃取柱進行凈化時，氟苯尼考、氟苯尼考胺的回收率為70％～75％，在進行對比試驗時，不過柱處理，將備用液直接氮吹，之后用水復溶，經過兩次正己烷凈化處理后，氟苯尼考和氟苯尼考胺的回收率均能達到85％以上，并且凈化液在通過0.22 μm的濾膜時無阻力，濾液清澈，說明此方法符合要求。本研究流動相A為0.1％氨水，流動相B為乙腈，弱極性的氟苯尼考保留性較強，而極性較強的氟苯尼考胺保留性較弱，保留時間不到2 min，因此選擇低流速0.3 mL/min以延長氟苯尼考胺的保留時間。氟苯尼考質譜條件較為成熟，負模式電噴霧離子源定性離子為 －184.9，定量離子為－335.9。氟苯尼考胺為堿性樣品，在正模式電噴霧離子源掃描下，130.1為定性離子，229.9為定量離子。在此條件下其豐度值大，受雜質干擾小。本試驗中，在氟苯尼考胺保留時間之前，通過切換閥將流動相中強干擾物質切換到廢液中，可以減少對目標物的干擾。4.2 方法學評價本研究建立的氟苯尼考殘留量檢測方法，其檢測限和定量限分別為5 μg/kg和10 μg/kg。在10 μg/kg～4 000 μg/kg范圍內，氟苯尼考和氟苯尼考胺在各組織的空白添加標準曲線線性關系良好，相關系數均在0.99以上。各組織空白樣品添加濃度在10 μg/kg、500 μg/kg和2 000 μg/kg時，回收率均大于85％，批間和批內變異系數均小于3％。該方法適用于豬可食性組織中氟苯尼考殘留量的測定。

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