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銅對豬原代培養(yǎng)肝細(xì)胞中銅藍(lán)蛋白酶活性的影響

來源:    作者:    時(shí)間: 2006-08-01

銅是人類和動(dòng)物機(jī)體必需的微量元素之一。銅不僅參與動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸、脂肪、碳水化合物、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)的代謝,而且還在骨骼發(fā)育、生殖、免疫、凝血、生物膜穩(wěn)定等生理機(jī)能中擔(dān)負(fù)著重要作用。

高銅對豬的促生長效應(yīng)，一直是動(dòng)物營養(yǎng)界的一大熱門研究領(lǐng)域。肝臟是動(dòng)物體內(nèi)第二大消化器官，在機(jī)體的營養(yǎng)代謝過程中起著重要作用。被譽(yù)為“物質(zhì)代謝中樞”。已知肝臟所分泌的酶有數(shù)百種以上，其中與銅密切相關(guān)的含銅酶主要有銅藍(lán)蛋白（cerulo plasmin,CP）和銅鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)等等。

微量元素銅不僅參與動(dòng)物體內(nèi)造血過程，而且也是多種酶的組成成分，對維護(hù)動(dòng)物正常生理機(jī)能至關(guān)重要, 血漿銅藍(lán)蛋白是血漿中最豐富的含銅蛋白，其絡(luò)合血漿70%～95%的銅，每個(gè)分子在不同位點(diǎn)共結(jié)合6-7個(gè)銅原子，將銅傳遞給細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。銅藍(lán)蛋白(CP)是一種具有抗氧化性、能強(qiáng)有力地抑制脂類自身氧化、清除體內(nèi)自由基的蛋白。肝臟是合成CP的主要器官，CP主要由肝細(xì)胞合成并分泌進(jìn)入血液，被輸送到全身組織發(fā)揮各種生理功能。

本實(shí)驗(yàn)通過向體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞模型中添加銅，觀察其對肝細(xì)胞中銅藍(lán)蛋白酶活性的影響情況，尋求銅促生長與基因表達(dá)的內(nèi)在聯(lián)系，為進(jìn)一步闡明銅的促生長的機(jī)理提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)尋求銅促生長與含銅酶的內(nèi)在聯(lián)系，為進(jìn)一步闡明銅的促生長的機(jī)理提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料   

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 

選用初生1-3d日齡 “軍牧1號(hào)” 健康仔豬，作為肝細(xì)胞供體，雌雄不限，體重0.5-1.0kg。由吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部動(dòng)物繁育中心種豬場提供。

1.1.2 試劑

細(xì)胞培養(yǎng)試劑:Ⅳ型膠原酶（collagenase typeⅣ）、胰蛋白酶（1：250）、D-Hanks

RPMI1640綜合培養(yǎng)基購自Gibco公司；新生牛血清（NBS）、臺(tái)盼藍(lán) 為Sigma公司產(chǎn)品，

乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、青、鏈霉素等為國產(chǎn)常規(guī)試劑。       

添加試劑： CuSO4·5H2O為國產(chǎn)分析純。

酶活性檢測試劑：銅藍(lán)蛋白（CP）測定試劑盒 由南京建成生物工程公司生產(chǎn)。

1.1.3 儀器 

MCO-17AI型CO2培養(yǎng)箱(日本,SANYO公司)；

CQIC型倒置顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠）；

SW-CJ-IF型超凈工作臺(tái)；

AEG-120型電子天平；

6孔、12孔、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（丹麥NUCO公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原代肝細(xì)胞的分離

將仔豬頸動(dòng)脈放血處死，在無菌間中腹部消毒，采用外科手術(shù)留取肝組織10-15g，放入20ml 4℃預(yù)冷D-Hanks 緩沖液內(nèi)，迅速送入超凈工作臺(tái)。4℃預(yù)冷D-Hanks反復(fù)沖洗3次，置于另一新的平皿中，用眼科剪剪成2 mm3左右的組織塊,緩沖液沖洗2-3次，去除大量紅細(xì)胞等雜質(zhì)，加入1%的膠原酶Ⅳ5ml在培養(yǎng)箱中消化15-20min，棄消化液，緩沖液沖洗后，反復(fù)輕輕吹打，吸取細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液經(jīng)過45μm濾網(wǎng)過濾2次，離心收集細(xì)胞，加入含10%新生牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液。取混勻的細(xì)胞培養(yǎng)液1滴，臺(tái)盼藍(lán)染色，鏡下觀察計(jì)算細(xì)胞總數(shù)和細(xì)胞存活率。

1.2.2 肝細(xì)胞培養(yǎng)液中添加銅的試驗(yàn)

肝細(xì)胞的條件培養(yǎng)液組成：在含10%血清細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，加入 配制的不同濃度的銅添加液。每0.95mL培養(yǎng)液，加入對應(yīng)濃度的銅添加液50μL，使銅的終濃度為0、15.6、31.2、46.8、62.4、78.0、93.6μmol/L 。標(biāo)記為對照組（0）和試驗(yàn)（A-F）組（依濃度由低到高順序）。對照組為含10%血清細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液。

待細(xì)胞貼壁良好、長滿單層，達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求即可開始實(shí)驗(yàn)。首先，吸出基礎(chǔ)培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)液沖洗3次，每孔加入相應(yīng)濃度含10%血清的不同銅濃度的條件培養(yǎng)液1.0ml。每孔為一個(gè)處理，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)(孔)。按計(jì)劃時(shí)間收取細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔1.0mL，分裝到高壓滅菌1.5mL離心管中，-80℃保存待檢。

1.2.3 銅藍(lán)蛋白(CP)的測定

用鄰聯(lián)大茴香胺法（南京建成生物工程公司試劑盒）。其測定原理是：CP催化聯(lián)大茴香胺轉(zhuǎn)變成淡黃棕色產(chǎn)物，加終止劑后形成紫紅色溶液在540nm測定吸光度，根據(jù)產(chǎn)物的吸光系數(shù)可計(jì)算酶的活力。測試過程按試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用X±S表示，用SPSS10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并用ANOVA（方差分析）分析方法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2  結(jié)果

2.1 豬肝細(xì)胞產(chǎn)率及活率

     應(yīng)用剪切消化法分離細(xì)胞，按臺(tái)盼藍(lán)排除法測定,平均每克豬肝能獲得8.1×107個(gè)肝細(xì)胞。獲得的肝細(xì)胞即時(shí)存活率平均可達(dá)93.4%，培養(yǎng)存活率平均可達(dá)87.6%。

2.2  銅水平對細(xì)胞培養(yǎng)液銅藍(lán)蛋白（CP）活性的影響 

結(jié)果見表1。細(xì)胞培養(yǎng)液中添加銅后,與C 組和 D組CP活性顯著高于對照組(p<0.05)，A組和B組、F組與對照組差異不顯著，E組與各組差異不顯著。從圖1銅藍(lán)蛋白的變化趨勢來看，CP對于低濃度的銅反應(yīng)不明顯，隨銅濃度的增加其活性亦升高，濃度過高，其活性受抑制而呈降低趨勢。

表1 銅對肝細(xì)胞銅藍(lán)蛋白活性的影響

組別           銅濃度 μmol/L              銅藍(lán)蛋白（CP）（U/L）

O                  0                        3.00±0.18b

A                15.6                       2.79±0.49b

B                31.2                       3.12±0.18b

C                46.8                       4.19±0.34a

D                62.4                       4.30±0.09a

E                78.0                       3.66±0.39ab

F                93.6                       2.43±0.79b

注：同一列標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著p＜0.05；同一列標(biāo)有不同大寫字母表示差異極顯著p＜0.01；

3 討論

3.1原代肝細(xì)胞供體的選擇

在肝細(xì)胞供體的選擇上，成年肝、新生動(dòng)物肝和胎肝均有采用。本研究證實(shí)，成年豬肝臟組織連接多而緊密，分離困難，致使許多肝細(xì)胞受損，且酶消化時(shí)易發(fā)生組織塊周圍細(xì)胞過度消化，而組織塊中心的細(xì)胞尚未分離，因此，獲得的肝細(xì)胞不易成活；選用胎豬時(shí)又有肝臟體積小，細(xì)胞未分化，成纖維細(xì)胞容易大量增生，實(shí)驗(yàn)成本高等不足之處。新生仔豬的肝組織易分離，細(xì)胞分化、新生能力強(qiáng)，新陳代謝旺盛，容易成活，肝組織體積能夠完全滿足試驗(yàn)需要。因此本試驗(yàn)選用出生1～3d的新生仔豬作為肝細(xì)胞供體。

3.3 體外培養(yǎng)原代肝細(xì)胞模型的建立

根據(jù)肝細(xì)胞是否傳代培養(yǎng)而分為原代肝細(xì)胞和傳代肝細(xì)胞株。目前, 多采用原代肝細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，主要原因是原代肝細(xì)胞在一定條件下在幾天內(nèi)，還具有體內(nèi)肝細(xì)胞的一些功能及活性, 增加了原代肝細(xì)胞的研究價(jià)值，故本試驗(yàn)采用體外培養(yǎng)的原代肝細(xì)胞作為試驗(yàn)對象。

肝細(xì)胞在體內(nèi)具有巨大的增殖潛能，可進(jìn)行多次細(xì)胞分裂。但肝細(xì)胞在體外增殖能力差。原代肝細(xì)胞僅能在1～2wk內(nèi)維持肝細(xì)胞的形態(tài)，具有良好的合成和分泌功能，之后便逐漸退化死亡 。據(jù)報(bào)道[3]分離后大鼠的肝細(xì)胞的白蛋白及總蛋白的合成能力保持較高水平的時(shí)間可達(dá)10d左右。反映肝細(xì)胞再生能力的甲胎蛋白的合成高峰在培養(yǎng)的第3～7d之后逐漸下降。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)豬原代肝細(xì)胞增殖能力在培養(yǎng)的第1～2d，處于從機(jī)械損傷和酶消化損傷的恢復(fù)階段及適應(yīng)新環(huán)境階段，第3～5d處于上升階段，之后處于平穩(wěn)維持階段。隨著離體時(shí)間的延長，肝細(xì)胞的狀態(tài)變化越大。因此本試驗(yàn)選擇培養(yǎng)1～7d的豬原代肝細(xì)胞作為體外培養(yǎng)模型的研究階段，在此期間采取觀測樣品,肝細(xì)胞活性和功能良好，比較接近體內(nèi)狀態(tài)。

3.4 銅對肝細(xì)胞銅藍(lán)蛋白活性的影響

銅藍(lán)蛋白是存在于人類及脊椎動(dòng)物的唯一的多銅氧化酶, 是一種豐富的血清α2-糖蛋白，分子量大約132KD，屬于多核銅藍(lán)氧化酶家族, 血清銅藍(lán)蛋白是一種抗氧化劑, 它能清除體內(nèi)的超氧化物自由基,在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡及保障機(jī)體正常功能等方面均有十分重要的意義。

有資料表明，CP的升高與下列情況有關(guān)，當(dāng)體內(nèi)各種代謝功能增強(qiáng)，肝臟合成代謝加速，釋放的CP增多，故CP水平就升高；另外當(dāng)體內(nèi)各種生物合成加速時(shí)而需要大量ATP。ATP的產(chǎn)生又需要細(xì)胞色素氧化酶的催化，且銅為細(xì)胞色素氧化酶所必需，其濃度與氧化酶的活性及血清銅的含量有平行關(guān)系，所以當(dāng)合成加速時(shí)，不僅需要大量的ATP提供能量，而且需要大量的細(xì)胞色素氧化酶參與，因此，機(jī)體CP含量就會(huì)升高。故肝細(xì)胞CP活性的高低于機(jī)體的合成代謝存在著內(nèi)在的聯(lián)系。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加不同濃度的銅，能夠在一定程度上提高CP的活性，但當(dāng)銅濃度過高時(shí)，CP活性則呈下降趨勢。這與銅促生長現(xiàn)象相吻合，低濃度的銅沒有促生長作用，125～250mg/kg的銅有明顯促生長作用，超過這個(gè)限度則產(chǎn)生銅中毒現(xiàn)象。據(jù)此認(rèn)為，較高濃度的銅可能是通過提高銅藍(lán)蛋白酶的活性來加速體內(nèi)生物合成，參與動(dòng)物的生長過程的。

    綜上所述，通過試驗(yàn)，使我們明確的認(rèn)識(shí)到肝細(xì)胞中含銅酶CP水平的變化與銅的添加有著一定聯(lián)系，表明銅的濃度改變導(dǎo)致銅藍(lán)蛋白的活性改變，與動(dòng)物體內(nèi)的生理、生化代謝過程有著密切的關(guān)系，為探究高銅促生長機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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