摘 要 本試驗(yàn)利用體外酶學(xué)試驗(yàn)法研究了氨基酸螯合鐵對(duì)ALA合成酶活力的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明：① 當(dāng)酶反應(yīng)體系中血紅素濃度為5×10-5mol/L時(shí)，對(duì)ALA合成酶有抑制作用。② 不同鐵源對(duì)ALA合成酶的活性有促進(jìn)作用，而且不同鐵源對(duì)ALA合成酶活性的影響程度不同，甘氨酸和硫酸亞鐵混合物組 > 硫酸亞鐵組 > 賴氨酸和硫酸亞鐵混合物組 > 賴氨酸螯合鐵組 > 甘氨酸螯合鐵組。
關(guān)鍵詞 血紅素，硫酸亞鐵，賴氨酸螯合鐵，甘氨酸螯合鐵，
合成對(duì)血紅素代謝的研究表明，ALA（δ-氨基-γ-酮戊酸，δ-Aminolaevulinic acid）合成酶是血紅素合成酶系中的限速酶（顧天爵 1988）。研究表明血紅素對(duì)此酶有反饋抑制作用。在一般情況下，血紅素合成后，迅速與珠蛋白結(jié)合形成血紅蛋白，不致有過多的血紅素堆積，對(duì)ALA合成酶不引起反饋抑制。如果血紅素的合成速度大于珠蛋白的合成速度，過多的血紅素可氧化成高鐵血紅素。研究表明，當(dāng)亞鐵血紅素的濃度為10-6mol/L時(shí)可抑制ALA合成酶的合成，為10-5~-4mol/L時(shí)可抑制ALA合成酶的活性（血紅素的生理正常值為10-7~-6mol/L），而高鐵血紅素則是 ALA合成酶的強(qiáng)烈抑制劑。由于ALA合成酶受血紅素含量（終產(chǎn)物的濃度）的調(diào)控，故根據(jù)生物化學(xué)的反饋抑制理論，提出一個(gè)假說：細(xì)胞內(nèi)若有氨基酸螯合物鐵存在，螯合物的結(jié)構(gòu)與血紅素相似，作為競爭性類似物，可能與ALA合成酶的控制中心結(jié)合，競爭結(jié)合調(diào)控位點(diǎn)，而這種結(jié)合只能是“類似”的，這種類似性不影響酶活力的變化，從而使 ALA合成酶能在“較多”血紅素存在時(shí)，仍有活性。基于以上理論和前幾個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)計(jì)了本試驗(yàn)，擬通過體外酶學(xué)試驗(yàn)，研究氨基酸螯合鐵對(duì)ALA合成酶活力的影響，推測氨基酸螯合鐵對(duì)血紅素合成的影響，為上述假說提供論據(jù)。
1 試驗(yàn)用試劑和儀器 ATP、磷酸吡哆醛、還原型谷胱甘肽、ALA標(biāo)準(zhǔn)物和血紅素由Sigma公司購入。琥珀酰-CoA合成酶（25℃時(shí)，10U/mg）由德國 Boehringer Mannheim公司購入。蔗糖、EDTA、Tris、甘氨酸、琥珀酸、MgCl2、三氯乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、對(duì)－二甲氨基苯甲醛、冰醋酸、過氯酸、二氯化汞、濃鹽酸、乙酰乙酸乙酯、冰醋酸、正丁醇、無水硫酸鈉等均為國產(chǎn)，產(chǎn)品等級(jí)為分析純試劑。 甘氨酸螯合鐵、賴氨酸螯合鐵為試驗(yàn)室制備品。玻璃勻漿器、HZS-H恒溫水浴振蕩箱、日本日立 SCR20BC 20000RPM冷凍離心機(jī)、日本島津UV-2401PC型紫外分光光度計(jì)。
2 試驗(yàn)實(shí)施的技術(shù)路線
2.1 線粒體的分離制備勻漿介質(zhì)：稱取85.55g蔗糖、0.01gEDTA、6.05gTris，溶于約800ml蒸餾水中，加入4.25ml 0.1mol/L HCl，最后用蒸餾水定容至1000ml，于0℃冰箱中保存，備用。具體操作：取新鮮豬肝臟，用預(yù)冷（0℃）的勻漿介質(zhì)洗凈，再用濾紙吸干表面水分，稱重。將肝用剪刀剪碎，按每克肝臟組織加8ml勻漿介質(zhì)，加入到玻璃勻漿器中，在冰浴中勻漿。待肝臟破碎后，移出到離心管中，在冷凍離心機(jī)上4 409×g離心15min，吸取上清液。上清液再在冷凍離心機(jī)上13 675×g離心30min，棄去上清液，余下的是線粒體部分。用勻漿介質(zhì)洗滌四次，凍存。將來用時(shí)，經(jīng)數(shù)次交替凍溶，使線粒體破碎，以此作為粗酶液。
2.2 反應(yīng)條件的確定主要方法參考Wider（1971）。取2ml反應(yīng)液于試管中，2ml反應(yīng)液組成如下：100μmol甘氨酸，100μmol琥珀酸，10μmol ATP，3.5μmol CoA，10μmol MgCl2，0.25μmol磷酸吡哆醛，10μmol還原型谷胱甘肽。50μmol Tris-HCl緩沖液（pH=7.2），1mg琥珀酰-CoA合成酶，精確數(shù)量的粗酶液。37℃保溫30分鐘，然后加入0.5ml 25%三氯乙酸，終止反應(yīng)。取樣分析ALA含量，如有ALA合成，說明上述反應(yīng)條件適用，否則加以修改。
2.3 影響ALA合成酶的因素的確定（試驗(yàn)設(shè)計(jì)）在2.2的基礎(chǔ)上，按下列計(jì)劃，加入可能影響ALA合成酶活性的物質(zhì)，然后測定ALA的生成量，以研究ALA合成 酶活性的變化情況。甘氨酸螯合鐵、賴氨酸螯合鐵、甘氨酸與硫酸亞鐵的混合物、賴氨酸與硫酸亞鐵的混合物、硫酸亞鐵,以上為同一濃度；亞鐵血紅素，分別為高和低兩個(gè)濃度。根據(jù)血紅素的生理正常值和抑制ALA合成酶活性時(shí)的濃度，本試驗(yàn)設(shè)定高血紅素濃度為5×10-5 mol/L，低血紅素濃度為5×10-7mol/L；甘氨酸螯合鐵、賴氨酸螯合鐵、甘氨酸與硫酸亞鐵的混合物、賴氨酸與硫酸亞鐵的混合物、硫酸亞鐵的濃度均設(shè)為5×10-5 mol/L（以鐵計(jì)）。
2.4 ALA生成量的測定采用的測定方法的原理為：ALA與乙酰乙酸乙酯在pH6.8及100℃的條件下作用生成吡咯衍生物，再與對(duì)—二甲氨基苯甲酸反應(yīng)，生成紅色化合物，用氯仿提取，比色定量。
2.5 酶活的表示方法 以單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生ALA的量為一個(gè)ALA合成酶活力單位（U）。
2.6 數(shù)據(jù)處理和分析試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用SAS（6.12版本）軟件中的GLM過程進(jìn)行方差分析和多重比較。圖形制作采用Microsoft Excel。
3 結(jié)果與分析試驗(yàn)結(jié)果見表1和圖1，不同鐵源對(duì)ALA合成酶活性的影響不同。硫酸亞鐵組和甘氨酸與硫酸亞鐵混合物組間差異不顯著（p>0.05），極顯著高于其它處理組（p<0.01），賴氨酸與硫酸亞鐵混合物組、賴氨酸螯合鐵組、甘氨酸螯合鐵和低血紅素組間差異不顯著（p>0.05），但顯著高于高血紅素組（p<0.05）。盡管低血紅素組與高血紅素組間在統(tǒng)計(jì)上差異不顯著（p>0.05），但從具體測值看，低血紅素組明顯高于高血紅素組。
4 討論反饋抑制是指反應(yīng)系統(tǒng)中最終產(chǎn)物對(duì)反應(yīng)中關(guān)鍵酶活力的抑制作用，是生物體內(nèi)快速調(diào)節(jié)酶活力的重要方式之一。生物體內(nèi)一系列代謝反應(yīng)的結(jié)果，逐漸造成了最終產(chǎn)物的積累，從而使反應(yīng)速度減慢，甚至停止，當(dāng)最終產(chǎn)物被消耗或轉(zhuǎn)移而使?jié)舛冉档蜁r(shí)，又逐漸形成有利于反應(yīng)進(jìn)行的環(huán)境，如此不斷地調(diào)節(jié)，猶如恒溫控制一樣。此時(shí)稱這種酶為變構(gòu)酶，稱最終產(chǎn)物為變構(gòu)抑制劑。有研究者用部分純化了的哺乳動(dòng)物肝中的ALA合成酶研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)血紅素的濃度為5×10-5 mol/L時(shí)(血紅素的生理正常值為10-7~10-6 mol/L)，可直接抑制ALA合成酶的活性，可見，血紅素對(duì)ALA合成酶有反饋抑制作用（歐陽培，1989）。關(guān)于反饋抑制作用機(jī)制的研究表明，在酶反應(yīng)體系中添加誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)物與變構(gòu)酶的控制中心結(jié)合，這種結(jié)合既不影響酶的活性，又能阻止最終產(chǎn)物與變構(gòu)酶結(jié)合,從而使酶的活性增加。那么，氨基酸螯合鐵的結(jié)構(gòu)與血紅素非常相似，在血紅素合成反應(yīng)中加入氨基酸螯合鐵，能否起到誘導(dǎo)物的作用？
盡管當(dāng)酶反應(yīng)體系中血紅素濃度為5×10-5 mol/L時(shí)（高血紅素組）測得的ALA合成酶的活性比血紅素濃度為5×10-7 mol/L（低血紅素組）時(shí)的測值低13.32%，但在統(tǒng)計(jì)上，高血紅素組和低血紅素組的測值間差異不顯著，這主要因?yàn)榻y(tǒng)計(jì)樣本量低（n=2）所致。本試驗(yàn)結(jié)果說明高血紅素組中血紅素對(duì)ALA合成酶有抑制作用，這與前人的研究結(jié)果一致（歐陽培，1989）。向反應(yīng)體系中分別加入甘氨酸和硫酸亞鐵的混合物或硫酸亞鐵（濃度為5×10-5 mol/L）后，測得的ALA合成酶的活性極顯著高于低血紅素組的測值，分別比低血紅素組高66.01%和57.70%，說明反應(yīng)體系中加入甘氨酸和硫酸亞鐵的混合物或硫酸亞鐵對(duì)ALA合成酶有促進(jìn)作用。盡管向反應(yīng)體系分別加入其它鐵源（賴氨酸和硫酸亞鐵混合物、甘氨酸螯合鐵和賴氨酸螯合鐵）后，ALA合成酶的活性與低血紅素組的測值間差異不顯著，但從具體測值看，幾種鐵源的加入不同程度地提高了ALA合成酶的活性（賴氨酸和硫酸亞鐵混合物組， 10.54%；賴氨酸螯合鐵組，6.39%；甘氨酸螯合鐵組，3.65%）。Wider（1971）用大豆細(xì)胞的研究表明，向酶反應(yīng)體系中加入Fe2+，可增強(qiáng)ALA合成酶的活性。Vogel（1960）用取自缺鐵鴨的血液的研究表明，向體外酶反應(yīng)體系中加入Fe2+能加強(qiáng)缺鐵細(xì)胞合成血紅素的能力，同時(shí)，他還發(fā)現(xiàn)，向反應(yīng)體系中同時(shí)加入Fe2+和甘氨酸，對(duì)血紅素合成的促進(jìn)作用比單獨(dú)加甘氨酸或鐵更強(qiáng)。本試驗(yàn)得到結(jié)果與他們的結(jié)果基本一致。比較分別加入各種鐵源后的各酶反應(yīng)體系，不難找出其中的區(qū)別。由2.2可見，酶反應(yīng)體系中含有甘氨酸（作為原料參加反應(yīng)），加入硫酸亞鐵后，整個(gè)反應(yīng)體系與加入甘氨酸和硫酸亞鐵混合物組類似。酶反應(yīng)體系的pH值為7.2，這樣的pH值極有利于形成氨基酸螯合鐵，由此可以推測酶反應(yīng)體系中形成了絡(luò)陽離子型甘氨酸螯合鐵。甘氨酸螯合鐵的化學(xué)結(jié)構(gòu)與血紅素中卟啉環(huán)上的吡咯極為相似。甘氨酸螯合鐵作為競爭性類似物，可能與ALA合成酶的控制中心結(jié)合，競爭結(jié)合調(diào)控位點(diǎn)，從而對(duì)ALA合成酶的活性有影響。賴氨酸螯合鐵由于有側(cè)鏈，化學(xué)結(jié)構(gòu)與血紅素中卟啉環(huán)上的吡咯有些差別，可能不會(huì)產(chǎn)生上述作用，本試驗(yàn)得到的結(jié)果也支持這一點(diǎn)。由于賴氨酸螯合鐵和甘氨酸螯合鐵的穩(wěn)定常數(shù)相近，向酶反應(yīng)體系中加入賴氨酸和硫酸亞鐵混合物后，兩種螯合鐵都可能形成，但由試驗(yàn)結(jié)果可見，賴氨酸螯合鐵和甘氨酸螯合鐵共存時(shí)對(duì)ALA合成酶的影響不如只有甘氨酸螯合鐵時(shí)大。是由于當(dāng)Fe2+、賴氨酸和甘氨酸共存時(shí)形成了更為復(fù)雜的化合物還是其它原因有待于進(jìn)一步試驗(yàn)確定。
由試驗(yàn)結(jié)果可見，向反應(yīng)體系中分別加入賴氨酸螯合鐵和甘氨酸螯合鐵（內(nèi)絡(luò)鹽型）對(duì)ALA合成酶的活性也有影響，但不如前三種鐵源的強(qiáng)，主要由于在pH值為7.2的溶液（本試驗(yàn)的反應(yīng)體系）中，氨基酸螯合鐵（內(nèi)絡(luò)鹽型）的溶解度較低，這與第一章和第二章得到的結(jié)果并不矛盾，因?yàn)樵谛∧c液中，氨基酸螯合鐵的溶解度得到大幅度提高（廖益平，1999）。
本試驗(yàn)得到的結(jié)果只能為前面的假說的成立（細(xì)胞內(nèi)若有氨基酸鐵螯合物存在，螯合物的結(jié)構(gòu)與血紅素相似，作為競爭性類似物，可能與ALA合成酶的控制中心結(jié)合，而這種結(jié)合只能是“類似”的，這種類似性不影響酶活力的變化，從而使ALA合成酶能在“較多”血紅素存在時(shí)，仍有活性）提供一個(gè)有力的證據(jù)，要想證明假說的正確性，必須進(jìn)行更深入的生化研究。
5 結(jié)論
（1）當(dāng)酶反應(yīng)體系中血紅素濃度為5×10-5 mol/L時(shí)，對(duì)ALA合成酶有抑制作用。
（2）不同鐵源對(duì)ALA合成酶的活性有促進(jìn)作用，而且不同鐵源對(duì)ALA合成酶活性的影響程度不同，甘氨酸和硫酸亞鐵混合物組>硫酸亞鐵組>賴氨酸和硫酸亞鐵混合物組>賴氨酸螯合鐵組>甘氨酸螯合鐵組。
關(guān)鍵詞 血紅素，硫酸亞鐵，賴氨酸螯合鐵，甘氨酸螯合鐵，
合成對(duì)血紅素代謝的研究表明，ALA（δ-氨基-γ-酮戊酸，δ-Aminolaevulinic acid）合成酶是血紅素合成酶系中的限速酶（顧天爵 1988）。研究表明血紅素對(duì)此酶有反饋抑制作用。在一般情況下，血紅素合成后，迅速與珠蛋白結(jié)合形成血紅蛋白，不致有過多的血紅素堆積，對(duì)ALA合成酶不引起反饋抑制。如果血紅素的合成速度大于珠蛋白的合成速度，過多的血紅素可氧化成高鐵血紅素。研究表明，當(dāng)亞鐵血紅素的濃度為10-6mol/L時(shí)可抑制ALA合成酶的合成，為10-5~-4mol/L時(shí)可抑制ALA合成酶的活性（血紅素的生理正常值為10-7~-6mol/L），而高鐵血紅素則是 ALA合成酶的強(qiáng)烈抑制劑。由于ALA合成酶受血紅素含量（終產(chǎn)物的濃度）的調(diào)控，故根據(jù)生物化學(xué)的反饋抑制理論，提出一個(gè)假說：細(xì)胞內(nèi)若有氨基酸螯合物鐵存在，螯合物的結(jié)構(gòu)與血紅素相似，作為競爭性類似物，可能與ALA合成酶的控制中心結(jié)合，競爭結(jié)合調(diào)控位點(diǎn)，而這種結(jié)合只能是“類似”的，這種類似性不影響酶活力的變化，從而使 ALA合成酶能在“較多”血紅素存在時(shí)，仍有活性。基于以上理論和前幾個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)計(jì)了本試驗(yàn)，擬通過體外酶學(xué)試驗(yàn)，研究氨基酸螯合鐵對(duì)ALA合成酶活力的影響，推測氨基酸螯合鐵對(duì)血紅素合成的影響，為上述假說提供論據(jù)。
1 試驗(yàn)用試劑和儀器 ATP、磷酸吡哆醛、還原型谷胱甘肽、ALA標(biāo)準(zhǔn)物和血紅素由Sigma公司購入。琥珀酰-CoA合成酶（25℃時(shí)，10U/mg）由德國 Boehringer Mannheim公司購入。蔗糖、EDTA、Tris、甘氨酸、琥珀酸、MgCl2、三氯乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、對(duì)－二甲氨基苯甲醛、冰醋酸、過氯酸、二氯化汞、濃鹽酸、乙酰乙酸乙酯、冰醋酸、正丁醇、無水硫酸鈉等均為國產(chǎn)，產(chǎn)品等級(jí)為分析純試劑。 甘氨酸螯合鐵、賴氨酸螯合鐵為試驗(yàn)室制備品。玻璃勻漿器、HZS-H恒溫水浴振蕩箱、日本日立 SCR20BC 20000RPM冷凍離心機(jī)、日本島津UV-2401PC型紫外分光光度計(jì)。
2 試驗(yàn)實(shí)施的技術(shù)路線
2.1 線粒體的分離制備勻漿介質(zhì)：稱取85.55g蔗糖、0.01gEDTA、6.05gTris，溶于約800ml蒸餾水中，加入4.25ml 0.1mol/L HCl，最后用蒸餾水定容至1000ml，于0℃冰箱中保存，備用。具體操作：取新鮮豬肝臟，用預(yù)冷（0℃）的勻漿介質(zhì)洗凈，再用濾紙吸干表面水分，稱重。將肝用剪刀剪碎，按每克肝臟組織加8ml勻漿介質(zhì)，加入到玻璃勻漿器中，在冰浴中勻漿。待肝臟破碎后，移出到離心管中，在冷凍離心機(jī)上4 409×g離心15min，吸取上清液。上清液再在冷凍離心機(jī)上13 675×g離心30min，棄去上清液，余下的是線粒體部分。用勻漿介質(zhì)洗滌四次，凍存。將來用時(shí)，經(jīng)數(shù)次交替凍溶，使線粒體破碎，以此作為粗酶液。
2.2 反應(yīng)條件的確定主要方法參考Wider（1971）。取2ml反應(yīng)液于試管中，2ml反應(yīng)液組成如下：100μmol甘氨酸，100μmol琥珀酸，10μmol ATP，3.5μmol CoA，10μmol MgCl2，0.25μmol磷酸吡哆醛，10μmol還原型谷胱甘肽。50μmol Tris-HCl緩沖液（pH=7.2），1mg琥珀酰-CoA合成酶，精確數(shù)量的粗酶液。37℃保溫30分鐘，然后加入0.5ml 25%三氯乙酸，終止反應(yīng)。取樣分析ALA含量，如有ALA合成，說明上述反應(yīng)條件適用，否則加以修改。
2.3 影響ALA合成酶的因素的確定（試驗(yàn)設(shè)計(jì)）在2.2的基礎(chǔ)上，按下列計(jì)劃，加入可能影響ALA合成酶活性的物質(zhì)，然后測定ALA的生成量，以研究ALA合成 酶活性的變化情況。甘氨酸螯合鐵、賴氨酸螯合鐵、甘氨酸與硫酸亞鐵的混合物、賴氨酸與硫酸亞鐵的混合物、硫酸亞鐵,以上為同一濃度；亞鐵血紅素，分別為高和低兩個(gè)濃度。根據(jù)血紅素的生理正常值和抑制ALA合成酶活性時(shí)的濃度，本試驗(yàn)設(shè)定高血紅素濃度為5×10-5 mol/L，低血紅素濃度為5×10-7mol/L；甘氨酸螯合鐵、賴氨酸螯合鐵、甘氨酸與硫酸亞鐵的混合物、賴氨酸與硫酸亞鐵的混合物、硫酸亞鐵的濃度均設(shè)為5×10-5 mol/L（以鐵計(jì)）。
2.4 ALA生成量的測定采用的測定方法的原理為：ALA與乙酰乙酸乙酯在pH6.8及100℃的條件下作用生成吡咯衍生物，再與對(duì)—二甲氨基苯甲酸反應(yīng)，生成紅色化合物，用氯仿提取，比色定量。
2.5 酶活的表示方法 以單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生ALA的量為一個(gè)ALA合成酶活力單位（U）。
2.6 數(shù)據(jù)處理和分析試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用SAS（6.12版本）軟件中的GLM過程進(jìn)行方差分析和多重比較。圖形制作采用Microsoft Excel。
3 結(jié)果與分析試驗(yàn)結(jié)果見表1和圖1，不同鐵源對(duì)ALA合成酶活性的影響不同。硫酸亞鐵組和甘氨酸與硫酸亞鐵混合物組間差異不顯著（p>0.05），極顯著高于其它處理組（p<0.01），賴氨酸與硫酸亞鐵混合物組、賴氨酸螯合鐵組、甘氨酸螯合鐵和低血紅素組間差異不顯著（p>0.05），但顯著高于高血紅素組（p<0.05）。盡管低血紅素組與高血紅素組間在統(tǒng)計(jì)上差異不顯著（p>0.05），但從具體測值看，低血紅素組明顯高于高血紅素組。
4 討論反饋抑制是指反應(yīng)系統(tǒng)中最終產(chǎn)物對(duì)反應(yīng)中關(guān)鍵酶活力的抑制作用，是生物體內(nèi)快速調(diào)節(jié)酶活力的重要方式之一。生物體內(nèi)一系列代謝反應(yīng)的結(jié)果，逐漸造成了最終產(chǎn)物的積累，從而使反應(yīng)速度減慢，甚至停止，當(dāng)最終產(chǎn)物被消耗或轉(zhuǎn)移而使?jié)舛冉档蜁r(shí)，又逐漸形成有利于反應(yīng)進(jìn)行的環(huán)境，如此不斷地調(diào)節(jié)，猶如恒溫控制一樣。此時(shí)稱這種酶為變構(gòu)酶，稱最終產(chǎn)物為變構(gòu)抑制劑。有研究者用部分純化了的哺乳動(dòng)物肝中的ALA合成酶研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)血紅素的濃度為5×10-5 mol/L時(shí)(血紅素的生理正常值為10-7~10-6 mol/L)，可直接抑制ALA合成酶的活性，可見，血紅素對(duì)ALA合成酶有反饋抑制作用（歐陽培，1989）。關(guān)于反饋抑制作用機(jī)制的研究表明，在酶反應(yīng)體系中添加誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)物與變構(gòu)酶的控制中心結(jié)合，這種結(jié)合既不影響酶的活性，又能阻止最終產(chǎn)物與變構(gòu)酶結(jié)合,從而使酶的活性增加。那么，氨基酸螯合鐵的結(jié)構(gòu)與血紅素非常相似，在血紅素合成反應(yīng)中加入氨基酸螯合鐵，能否起到誘導(dǎo)物的作用？
盡管當(dāng)酶反應(yīng)體系中血紅素濃度為5×10-5 mol/L時(shí)（高血紅素組）測得的ALA合成酶的活性比血紅素濃度為5×10-7 mol/L（低血紅素組）時(shí)的測值低13.32%，但在統(tǒng)計(jì)上，高血紅素組和低血紅素組的測值間差異不顯著，這主要因?yàn)榻y(tǒng)計(jì)樣本量低（n=2）所致。本試驗(yàn)結(jié)果說明高血紅素組中血紅素對(duì)ALA合成酶有抑制作用，這與前人的研究結(jié)果一致（歐陽培，1989）。向反應(yīng)體系中分別加入甘氨酸和硫酸亞鐵的混合物或硫酸亞鐵（濃度為5×10-5 mol/L）后，測得的ALA合成酶的活性極顯著高于低血紅素組的測值，分別比低血紅素組高66.01%和57.70%，說明反應(yīng)體系中加入甘氨酸和硫酸亞鐵的混合物或硫酸亞鐵對(duì)ALA合成酶有促進(jìn)作用。盡管向反應(yīng)體系分別加入其它鐵源（賴氨酸和硫酸亞鐵混合物、甘氨酸螯合鐵和賴氨酸螯合鐵）后，ALA合成酶的活性與低血紅素組的測值間差異不顯著，但從具體測值看，幾種鐵源的加入不同程度地提高了ALA合成酶的活性（賴氨酸和硫酸亞鐵混合物組， 10.54%；賴氨酸螯合鐵組，6.39%；甘氨酸螯合鐵組，3.65%）。Wider（1971）用大豆細(xì)胞的研究表明，向酶反應(yīng)體系中加入Fe2+，可增強(qiáng)ALA合成酶的活性。Vogel（1960）用取自缺鐵鴨的血液的研究表明，向體外酶反應(yīng)體系中加入Fe2+能加強(qiáng)缺鐵細(xì)胞合成血紅素的能力，同時(shí)，他還發(fā)現(xiàn)，向反應(yīng)體系中同時(shí)加入Fe2+和甘氨酸，對(duì)血紅素合成的促進(jìn)作用比單獨(dú)加甘氨酸或鐵更強(qiáng)。本試驗(yàn)得到結(jié)果與他們的結(jié)果基本一致。比較分別加入各種鐵源后的各酶反應(yīng)體系，不難找出其中的區(qū)別。由2.2可見，酶反應(yīng)體系中含有甘氨酸（作為原料參加反應(yīng)），加入硫酸亞鐵后，整個(gè)反應(yīng)體系與加入甘氨酸和硫酸亞鐵混合物組類似。酶反應(yīng)體系的pH值為7.2，這樣的pH值極有利于形成氨基酸螯合鐵，由此可以推測酶反應(yīng)體系中形成了絡(luò)陽離子型甘氨酸螯合鐵。甘氨酸螯合鐵的化學(xué)結(jié)構(gòu)與血紅素中卟啉環(huán)上的吡咯極為相似。甘氨酸螯合鐵作為競爭性類似物，可能與ALA合成酶的控制中心結(jié)合，競爭結(jié)合調(diào)控位點(diǎn)，從而對(duì)ALA合成酶的活性有影響。賴氨酸螯合鐵由于有側(cè)鏈，化學(xué)結(jié)構(gòu)與血紅素中卟啉環(huán)上的吡咯有些差別，可能不會(huì)產(chǎn)生上述作用，本試驗(yàn)得到的結(jié)果也支持這一點(diǎn)。由于賴氨酸螯合鐵和甘氨酸螯合鐵的穩(wěn)定常數(shù)相近，向酶反應(yīng)體系中加入賴氨酸和硫酸亞鐵混合物后，兩種螯合鐵都可能形成，但由試驗(yàn)結(jié)果可見，賴氨酸螯合鐵和甘氨酸螯合鐵共存時(shí)對(duì)ALA合成酶的影響不如只有甘氨酸螯合鐵時(shí)大。是由于當(dāng)Fe2+、賴氨酸和甘氨酸共存時(shí)形成了更為復(fù)雜的化合物還是其它原因有待于進(jìn)一步試驗(yàn)確定。
由試驗(yàn)結(jié)果可見，向反應(yīng)體系中分別加入賴氨酸螯合鐵和甘氨酸螯合鐵（內(nèi)絡(luò)鹽型）對(duì)ALA合成酶的活性也有影響，但不如前三種鐵源的強(qiáng)，主要由于在pH值為7.2的溶液（本試驗(yàn)的反應(yīng)體系）中，氨基酸螯合鐵（內(nèi)絡(luò)鹽型）的溶解度較低，這與第一章和第二章得到的結(jié)果并不矛盾，因?yàn)樵谛∧c液中，氨基酸螯合鐵的溶解度得到大幅度提高（廖益平，1999）。
本試驗(yàn)得到的結(jié)果只能為前面的假說的成立（細(xì)胞內(nèi)若有氨基酸鐵螯合物存在，螯合物的結(jié)構(gòu)與血紅素相似，作為競爭性類似物，可能與ALA合成酶的控制中心結(jié)合，而這種結(jié)合只能是“類似”的，這種類似性不影響酶活力的變化，從而使ALA合成酶能在“較多”血紅素存在時(shí)，仍有活性）提供一個(gè)有力的證據(jù)，要想證明假說的正確性，必須進(jìn)行更深入的生化研究。
5 結(jié)論
（1）當(dāng)酶反應(yīng)體系中血紅素濃度為5×10-5 mol/L時(shí)，對(duì)ALA合成酶有抑制作用。
（2）不同鐵源對(duì)ALA合成酶的活性有促進(jìn)作用，而且不同鐵源對(duì)ALA合成酶活性的影響程度不同，甘氨酸和硫酸亞鐵混合物組>硫酸亞鐵組>賴氨酸和硫酸亞鐵混合物組>賴氨酸螯合鐵組>甘氨酸螯合鐵組。
