摘 要 本試驗利用體外酶學試驗法研究了氨基酸螯合鐵對ALA合成酶活力的影響。試驗結果表明：① 當酶反應體系中血紅素濃度為5×10-5mol/L時，對ALA合成酶有抑制作用。② 不同鐵源對ALA合成酶的活性有促進作用，而且不同鐵源對ALA合成酶活性的影響程度不同，甘氨酸和硫酸亞鐵混合物組 > 硫酸亞鐵組 > 賴氨酸和硫酸亞鐵混合物組 > 賴氨酸螯合鐵組 > 甘氨酸螯合鐵組。
關鍵詞 血紅素，硫酸亞鐵，賴氨酸螯合鐵，甘氨酸螯合鐵，
合成對血紅素代謝的研究表明，ALA（δ-氨基-γ-酮戊酸，δ-Aminolaevulinic acid）合成酶是血紅素合成酶系中的限速酶（顧天爵 1988）。研究表明血紅素對此酶有反饋抑制作用。在一般情況下，血紅素合成后，迅速與珠蛋白結合形成血紅蛋白，不致有過多的血紅素堆積，對ALA合成酶不引起反饋抑制。如果血紅素的合成速度大于珠蛋白的合成速度，過多的血紅素可氧化成高鐵血紅素。研究表明，當亞鐵血紅素的濃度為10-6mol/L時可抑制ALA合成酶的合成，為10-5~-4mol/L時可抑制ALA合成酶的活性（血紅素的生理正常值為10-7~-6mol/L），而高鐵血紅素則是 ALA合成酶的強烈抑制劑。由于ALA合成酶受血紅素含量（終產物的濃度）的調控，故根據生物化學的反饋抑制理論，提出一個假說：細胞內若有氨基酸螯合物鐵存在，螯合物的結構與血紅素相似，作為競爭性類似物，可能與ALA合成酶的控制中心結合，競爭結合調控位點，而這種結合只能是“類似”的，這種類似性不影響酶活力的變化，從而使 ALA合成酶能在“較多”血紅素存在時，仍有活性。基于以上理論和前幾個試驗的結果，設計了本試驗，擬通過體外酶學試驗，研究氨基酸螯合鐵對ALA合成酶活力的影響，推測氨基酸螯合鐵對血紅素合成的影響，為上述假說提供論據。
1 試驗用試劑和儀器 ATP、磷酸吡哆醛、還原型谷胱甘肽、ALA標準物和血紅素由Sigma公司購入。琥珀酰-CoA合成酶（25℃時，10U/mg）由德國 Boehringer Mannheim公司購入。蔗糖、EDTA、Tris、甘氨酸、琥珀酸、MgCl2、三氯乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、對－二甲氨基苯甲醛、冰醋酸、過氯酸、二氯化汞、濃鹽酸、乙酰乙酸乙酯、冰醋酸、正丁醇、無水硫酸鈉等均為國產，產品等級為分析純試劑。 甘氨酸螯合鐵、賴氨酸螯合鐵為試驗室制備品。玻璃勻漿器、HZS-H恒溫水浴振蕩箱、日本日立 SCR20BC 20000RPM冷凍離心機、日本島津UV-2401PC型紫外分光光度計。
2 試驗實施的技術路線
2.1 線粒體的分離制備勻漿介質：稱取85.55g蔗糖、0.01gEDTA、6.05gTris，溶于約800ml蒸餾水中，加入4.25ml 0.1mol/L HCl，最后用蒸餾水定容至1000ml，于0℃冰箱中保存，備用。具體操作：取新鮮豬肝臟，用預冷（0℃）的勻漿介質洗凈，再用濾紙吸干表面水分，稱重。將肝用剪刀剪碎，按每克肝臟組織加8ml勻漿介質，加入到玻璃勻漿器中，在冰浴中勻漿。待肝臟破碎后，移出到離心管中，在冷凍離心機上4 409×g離心15min，吸取上清液。上清液再在冷凍離心機上13 675×g離心30min，棄去上清液，余下的是線粒體部分。用勻漿介質洗滌四次，凍存。將來用時，經數次交替凍溶，使線粒體破碎，以此作為粗酶液。
2.2 反應條件的確定主要方法參考Wider（1971）。取2ml反應液于試管中，2ml反應液組成如下：100μmol甘氨酸，100μmol琥珀酸，10μmol ATP，3.5μmol CoA，10μmol MgCl2，0.25μmol磷酸吡哆醛，10μmol還原型谷胱甘肽。50μmol Tris-HCl緩沖液（pH=7.2），1mg琥珀酰-CoA合成酶，精確數量的粗酶液。37℃保溫30分鐘，然后加入0.5ml 25%三氯乙酸，終止反應。取樣分析ALA含量，如有ALA合成，說明上述反應條件適用，否則加以修改。
2.3 影響ALA合成酶的因素的確定（試驗設計）在2.2的基礎上，按下列計劃，加入可能影響ALA合成酶活性的物質，然后測定ALA的生成量，以研究ALA合成 酶活性的變化情況。甘氨酸螯合鐵、賴氨酸螯合鐵、甘氨酸與硫酸亞鐵的混合物、賴氨酸與硫酸亞鐵的混合物、硫酸亞鐵,以上為同一濃度；亞鐵血紅素，分別為高和低兩個濃度。根據血紅素的生理正常值和抑制ALA合成酶活性時的濃度，本試驗設定高血紅素濃度為5×10-5 mol/L，低血紅素濃度為5×10-7mol/L；甘氨酸螯合鐵、賴氨酸螯合鐵、甘氨酸與硫酸亞鐵的混合物、賴氨酸與硫酸亞鐵的混合物、硫酸亞鐵的濃度均設為5×10-5 mol/L（以鐵計）。
2.4 ALA生成量的測定采用的測定方法的原理為：ALA與乙酰乙酸乙酯在pH6.8及100℃的條件下作用生成吡咯衍生物，再與對—二甲氨基苯甲酸反應，生成紅色化合物，用氯仿提取，比色定量。
2.5 酶活的表示方法 以單位時間內產生ALA的量為一個ALA合成酶活力單位（U）。
2.6 數據處理和分析試驗所得數據用SAS（6.12版本）軟件中的GLM過程進行方差分析和多重比較。圖形制作采用Microsoft Excel。
3 結果與分析試驗結果見表1和圖1，不同鐵源對ALA合成酶活性的影響不同。硫酸亞鐵組和甘氨酸與硫酸亞鐵混合物組間差異不顯著（p>0.05），極顯著高于其它處理組（p<0.01），賴氨酸與硫酸亞鐵混合物組、賴氨酸螯合鐵組、甘氨酸螯合鐵和低血紅素組間差異不顯著（p>0.05），但顯著高于高血紅素組（p<0.05）。盡管低血紅素組與高血紅素組間在統計上差異不顯著（p>0.05），但從具體測值看，低血紅素組明顯高于高血紅素組。
4 討論反饋抑制是指反應系統中最終產物對反應中關鍵酶活力的抑制作用，是生物體內快速調節酶活力的重要方式之一。生物體內一系列代謝反應的結果，逐漸造成了最終產物的積累，從而使反應速度減慢，甚至停止，當最終產物被消耗或轉移而使濃度降低時，又逐漸形成有利于反應進行的環境，如此不斷地調節，猶如恒溫控制一樣。此時稱這種酶為變構酶，稱最終產物為變構抑制劑。有研究者用部分純化了的哺乳動物肝中的ALA合成酶研究發現，當血紅素的濃度為5×10-5 mol/L時(血紅素的生理正常值為10-7~10-6 mol/L)，可直接抑制ALA合成酶的活性，可見，血紅素對ALA合成酶有反饋抑制作用（歐陽培，1989）。關于反饋抑制作用機制的研究表明，在酶反應體系中添加誘導物，誘導物與變構酶的控制中心結合，這種結合既不影響酶的活性，又能阻止最終產物與變構酶結合,從而使酶的活性增加。那么，氨基酸螯合鐵的結構與血紅素非常相似，在血紅素合成反應中加入氨基酸螯合鐵，能否起到誘導物的作用？
盡管當酶反應體系中血紅素濃度為5×10-5 mol/L時（高血紅素組）測得的ALA合成酶的活性比血紅素濃度為5×10-7 mol/L（低血紅素組）時的測值低13.32%，但在統計上，高血紅素組和低血紅素組的測值間差異不顯著，這主要因為統計樣本量低（n=2）所致。本試驗結果說明高血紅素組中血紅素對ALA合成酶有抑制作用，這與前人的研究結果一致（歐陽培，1989）。向反應體系中分別加入甘氨酸和硫酸亞鐵的混合物或硫酸亞鐵（濃度為5×10-5 mol/L）后，測得的ALA合成酶的活性極顯著高于低血紅素組的測值，分別比低血紅素組高66.01%和57.70%，說明反應體系中加入甘氨酸和硫酸亞鐵的混合物或硫酸亞鐵對ALA合成酶有促進作用。盡管向反應體系分別加入其它鐵源（賴氨酸和硫酸亞鐵混合物、甘氨酸螯合鐵和賴氨酸螯合鐵）后，ALA合成酶的活性與低血紅素組的測值間差異不顯著，但從具體測值看，幾種鐵源的加入不同程度地提高了ALA合成酶的活性（賴氨酸和硫酸亞鐵混合物組， 10.54%；賴氨酸螯合鐵組，6.39%；甘氨酸螯合鐵組，3.65%）。Wider（1971）用大豆細胞的研究表明，向酶反應體系中加入Fe2+，可增強ALA合成酶的活性。Vogel（1960）用取自缺鐵鴨的血液的研究表明，向體外酶反應體系中加入Fe2+能加強缺鐵細胞合成血紅素的能力，同時，他還發現，向反應體系中同時加入Fe2+和甘氨酸，對血紅素合成的促進作用比單獨加甘氨酸或鐵更強。本試驗得到結果與他們的結果基本一致。比較分別加入各種鐵源后的各酶反應體系，不難找出其中的區別。由2.2可見，酶反應體系中含有甘氨酸（作為原料參加反應），加入硫酸亞鐵后，整個反應體系與加入甘氨酸和硫酸亞鐵混合物組類似。酶反應體系的pH值為7.2，這樣的pH值極有利于形成氨基酸螯合鐵，由此可以推測酶反應體系中形成了絡陽離子型甘氨酸螯合鐵。甘氨酸螯合鐵的化學結構與血紅素中卟啉環上的吡咯極為相似。甘氨酸螯合鐵作為競爭性類似物，可能與ALA合成酶的控制中心結合，競爭結合調控位點，從而對ALA合成酶的活性有影響。賴氨酸螯合鐵由于有側鏈，化學結構與血紅素中卟啉環上的吡咯有些差別，可能不會產生上述作用，本試驗得到的結果也支持這一點。由于賴氨酸螯合鐵和甘氨酸螯合鐵的穩定常數相近，向酶反應體系中加入賴氨酸和硫酸亞鐵混合物后，兩種螯合鐵都可能形成，但由試驗結果可見，賴氨酸螯合鐵和甘氨酸螯合鐵共存時對ALA合成酶的影響不如只有甘氨酸螯合鐵時大。是由于當Fe2+、賴氨酸和甘氨酸共存時形成了更為復雜的化合物還是其它原因有待于進一步試驗確定。
由試驗結果可見，向反應體系中分別加入賴氨酸螯合鐵和甘氨酸螯合鐵（內絡鹽型）對ALA合成酶的活性也有影響，但不如前三種鐵源的強，主要由于在pH值為7.2的溶液（本試驗的反應體系）中，氨基酸螯合鐵（內絡鹽型）的溶解度較低，這與第一章和第二章得到的結果并不矛盾，因為在小腸液中，氨基酸螯合鐵的溶解度得到大幅度提高（廖益平，1999）。
本試驗得到的結果只能為前面的假說的成立（細胞內若有氨基酸鐵螯合物存在，螯合物的結構與血紅素相似，作為競爭性類似物，可能與ALA合成酶的控制中心結合，而這種結合只能是“類似”的，這種類似性不影響酶活力的變化，從而使ALA合成酶能在“較多”血紅素存在時，仍有活性）提供一個有力的證據，要想證明假說的正確性，必須進行更深入的生化研究。
5 結論
（1）當酶反應體系中血紅素濃度為5×10-5 mol/L時，對ALA合成酶有抑制作用。
（2）不同鐵源對ALA合成酶的活性有促進作用，而且不同鐵源對ALA合成酶活性的影響程度不同，甘氨酸和硫酸亞鐵混合物組>硫酸亞鐵組>賴氨酸和硫酸亞鐵混合物組>賴氨酸螯合鐵組>甘氨酸螯合鐵組。
關鍵詞 血紅素，硫酸亞鐵，賴氨酸螯合鐵，甘氨酸螯合鐵，
合成對血紅素代謝的研究表明，ALA（δ-氨基-γ-酮戊酸，δ-Aminolaevulinic acid）合成酶是血紅素合成酶系中的限速酶（顧天爵 1988）。研究表明血紅素對此酶有反饋抑制作用。在一般情況下，血紅素合成后，迅速與珠蛋白結合形成血紅蛋白，不致有過多的血紅素堆積，對ALA合成酶不引起反饋抑制。如果血紅素的合成速度大于珠蛋白的合成速度，過多的血紅素可氧化成高鐵血紅素。研究表明，當亞鐵血紅素的濃度為10-6mol/L時可抑制ALA合成酶的合成，為10-5~-4mol/L時可抑制ALA合成酶的活性（血紅素的生理正常值為10-7~-6mol/L），而高鐵血紅素則是 ALA合成酶的強烈抑制劑。由于ALA合成酶受血紅素含量（終產物的濃度）的調控，故根據生物化學的反饋抑制理論，提出一個假說：細胞內若有氨基酸螯合物鐵存在，螯合物的結構與血紅素相似，作為競爭性類似物，可能與ALA合成酶的控制中心結合，競爭結合調控位點，而這種結合只能是“類似”的，這種類似性不影響酶活力的變化，從而使 ALA合成酶能在“較多”血紅素存在時，仍有活性。基于以上理論和前幾個試驗的結果，設計了本試驗，擬通過體外酶學試驗，研究氨基酸螯合鐵對ALA合成酶活力的影響，推測氨基酸螯合鐵對血紅素合成的影響，為上述假說提供論據。
1 試驗用試劑和儀器 ATP、磷酸吡哆醛、還原型谷胱甘肽、ALA標準物和血紅素由Sigma公司購入。琥珀酰-CoA合成酶（25℃時，10U/mg）由德國 Boehringer Mannheim公司購入。蔗糖、EDTA、Tris、甘氨酸、琥珀酸、MgCl2、三氯乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、對－二甲氨基苯甲醛、冰醋酸、過氯酸、二氯化汞、濃鹽酸、乙酰乙酸乙酯、冰醋酸、正丁醇、無水硫酸鈉等均為國產，產品等級為分析純試劑。 甘氨酸螯合鐵、賴氨酸螯合鐵為試驗室制備品。玻璃勻漿器、HZS-H恒溫水浴振蕩箱、日本日立 SCR20BC 20000RPM冷凍離心機、日本島津UV-2401PC型紫外分光光度計。
2 試驗實施的技術路線
2.1 線粒體的分離制備勻漿介質：稱取85.55g蔗糖、0.01gEDTA、6.05gTris，溶于約800ml蒸餾水中，加入4.25ml 0.1mol/L HCl，最后用蒸餾水定容至1000ml，于0℃冰箱中保存，備用。具體操作：取新鮮豬肝臟，用預冷（0℃）的勻漿介質洗凈，再用濾紙吸干表面水分，稱重。將肝用剪刀剪碎，按每克肝臟組織加8ml勻漿介質，加入到玻璃勻漿器中，在冰浴中勻漿。待肝臟破碎后，移出到離心管中，在冷凍離心機上4 409×g離心15min，吸取上清液。上清液再在冷凍離心機上13 675×g離心30min，棄去上清液，余下的是線粒體部分。用勻漿介質洗滌四次，凍存。將來用時，經數次交替凍溶，使線粒體破碎，以此作為粗酶液。
2.2 反應條件的確定主要方法參考Wider（1971）。取2ml反應液于試管中，2ml反應液組成如下：100μmol甘氨酸，100μmol琥珀酸，10μmol ATP，3.5μmol CoA，10μmol MgCl2，0.25μmol磷酸吡哆醛，10μmol還原型谷胱甘肽。50μmol Tris-HCl緩沖液（pH=7.2），1mg琥珀酰-CoA合成酶，精確數量的粗酶液。37℃保溫30分鐘，然后加入0.5ml 25%三氯乙酸，終止反應。取樣分析ALA含量，如有ALA合成，說明上述反應條件適用，否則加以修改。
2.3 影響ALA合成酶的因素的確定（試驗設計）在2.2的基礎上，按下列計劃，加入可能影響ALA合成酶活性的物質，然后測定ALA的生成量，以研究ALA合成 酶活性的變化情況。甘氨酸螯合鐵、賴氨酸螯合鐵、甘氨酸與硫酸亞鐵的混合物、賴氨酸與硫酸亞鐵的混合物、硫酸亞鐵,以上為同一濃度；亞鐵血紅素，分別為高和低兩個濃度。根據血紅素的生理正常值和抑制ALA合成酶活性時的濃度，本試驗設定高血紅素濃度為5×10-5 mol/L，低血紅素濃度為5×10-7mol/L；甘氨酸螯合鐵、賴氨酸螯合鐵、甘氨酸與硫酸亞鐵的混合物、賴氨酸與硫酸亞鐵的混合物、硫酸亞鐵的濃度均設為5×10-5 mol/L（以鐵計）。
2.4 ALA生成量的測定采用的測定方法的原理為：ALA與乙酰乙酸乙酯在pH6.8及100℃的條件下作用生成吡咯衍生物，再與對—二甲氨基苯甲酸反應，生成紅色化合物，用氯仿提取，比色定量。
2.5 酶活的表示方法 以單位時間內產生ALA的量為一個ALA合成酶活力單位（U）。
2.6 數據處理和分析試驗所得數據用SAS（6.12版本）軟件中的GLM過程進行方差分析和多重比較。圖形制作采用Microsoft Excel。
3 結果與分析試驗結果見表1和圖1，不同鐵源對ALA合成酶活性的影響不同。硫酸亞鐵組和甘氨酸與硫酸亞鐵混合物組間差異不顯著（p>0.05），極顯著高于其它處理組（p<0.01），賴氨酸與硫酸亞鐵混合物組、賴氨酸螯合鐵組、甘氨酸螯合鐵和低血紅素組間差異不顯著（p>0.05），但顯著高于高血紅素組（p<0.05）。盡管低血紅素組與高血紅素組間在統計上差異不顯著（p>0.05），但從具體測值看，低血紅素組明顯高于高血紅素組。
4 討論反饋抑制是指反應系統中最終產物對反應中關鍵酶活力的抑制作用，是生物體內快速調節酶活力的重要方式之一。生物體內一系列代謝反應的結果，逐漸造成了最終產物的積累，從而使反應速度減慢，甚至停止，當最終產物被消耗或轉移而使濃度降低時，又逐漸形成有利于反應進行的環境，如此不斷地調節，猶如恒溫控制一樣。此時稱這種酶為變構酶，稱最終產物為變構抑制劑。有研究者用部分純化了的哺乳動物肝中的ALA合成酶研究發現，當血紅素的濃度為5×10-5 mol/L時(血紅素的生理正常值為10-7~10-6 mol/L)，可直接抑制ALA合成酶的活性，可見，血紅素對ALA合成酶有反饋抑制作用（歐陽培，1989）。關于反饋抑制作用機制的研究表明，在酶反應體系中添加誘導物，誘導物與變構酶的控制中心結合，這種結合既不影響酶的活性，又能阻止最終產物與變構酶結合,從而使酶的活性增加。那么，氨基酸螯合鐵的結構與血紅素非常相似，在血紅素合成反應中加入氨基酸螯合鐵，能否起到誘導物的作用？
盡管當酶反應體系中血紅素濃度為5×10-5 mol/L時（高血紅素組）測得的ALA合成酶的活性比血紅素濃度為5×10-7 mol/L（低血紅素組）時的測值低13.32%，但在統計上，高血紅素組和低血紅素組的測值間差異不顯著，這主要因為統計樣本量低（n=2）所致。本試驗結果說明高血紅素組中血紅素對ALA合成酶有抑制作用，這與前人的研究結果一致（歐陽培，1989）。向反應體系中分別加入甘氨酸和硫酸亞鐵的混合物或硫酸亞鐵（濃度為5×10-5 mol/L）后，測得的ALA合成酶的活性極顯著高于低血紅素組的測值，分別比低血紅素組高66.01%和57.70%，說明反應體系中加入甘氨酸和硫酸亞鐵的混合物或硫酸亞鐵對ALA合成酶有促進作用。盡管向反應體系分別加入其它鐵源（賴氨酸和硫酸亞鐵混合物、甘氨酸螯合鐵和賴氨酸螯合鐵）后，ALA合成酶的活性與低血紅素組的測值間差異不顯著，但從具體測值看，幾種鐵源的加入不同程度地提高了ALA合成酶的活性（賴氨酸和硫酸亞鐵混合物組， 10.54%；賴氨酸螯合鐵組，6.39%；甘氨酸螯合鐵組，3.65%）。Wider（1971）用大豆細胞的研究表明，向酶反應體系中加入Fe2+，可增強ALA合成酶的活性。Vogel（1960）用取自缺鐵鴨的血液的研究表明，向體外酶反應體系中加入Fe2+能加強缺鐵細胞合成血紅素的能力，同時，他還發現，向反應體系中同時加入Fe2+和甘氨酸，對血紅素合成的促進作用比單獨加甘氨酸或鐵更強。本試驗得到結果與他們的結果基本一致。比較分別加入各種鐵源后的各酶反應體系，不難找出其中的區別。由2.2可見，酶反應體系中含有甘氨酸（作為原料參加反應），加入硫酸亞鐵后，整個反應體系與加入甘氨酸和硫酸亞鐵混合物組類似。酶反應體系的pH值為7.2，這樣的pH值極有利于形成氨基酸螯合鐵，由此可以推測酶反應體系中形成了絡陽離子型甘氨酸螯合鐵。甘氨酸螯合鐵的化學結構與血紅素中卟啉環上的吡咯極為相似。甘氨酸螯合鐵作為競爭性類似物，可能與ALA合成酶的控制中心結合，競爭結合調控位點，從而對ALA合成酶的活性有影響。賴氨酸螯合鐵由于有側鏈，化學結構與血紅素中卟啉環上的吡咯有些差別，可能不會產生上述作用，本試驗得到的結果也支持這一點。由于賴氨酸螯合鐵和甘氨酸螯合鐵的穩定常數相近，向酶反應體系中加入賴氨酸和硫酸亞鐵混合物后，兩種螯合鐵都可能形成，但由試驗結果可見，賴氨酸螯合鐵和甘氨酸螯合鐵共存時對ALA合成酶的影響不如只有甘氨酸螯合鐵時大。是由于當Fe2+、賴氨酸和甘氨酸共存時形成了更為復雜的化合物還是其它原因有待于進一步試驗確定。
由試驗結果可見，向反應體系中分別加入賴氨酸螯合鐵和甘氨酸螯合鐵（內絡鹽型）對ALA合成酶的活性也有影響，但不如前三種鐵源的強，主要由于在pH值為7.2的溶液（本試驗的反應體系）中，氨基酸螯合鐵（內絡鹽型）的溶解度較低，這與第一章和第二章得到的結果并不矛盾，因為在小腸液中，氨基酸螯合鐵的溶解度得到大幅度提高（廖益平，1999）。
本試驗得到的結果只能為前面的假說的成立（細胞內若有氨基酸鐵螯合物存在，螯合物的結構與血紅素相似，作為競爭性類似物，可能與ALA合成酶的控制中心結合，而這種結合只能是“類似”的，這種類似性不影響酶活力的變化，從而使ALA合成酶能在“較多”血紅素存在時，仍有活性）提供一個有力的證據，要想證明假說的正確性，必須進行更深入的生化研究。
5 結論
（1）當酶反應體系中血紅素濃度為5×10-5 mol/L時，對ALA合成酶有抑制作用。
（2）不同鐵源對ALA合成酶的活性有促進作用，而且不同鐵源對ALA合成酶活性的影響程度不同，甘氨酸和硫酸亞鐵混合物組>硫酸亞鐵組>賴氨酸和硫酸亞鐵混合物組>賴氨酸螯合鐵組>甘氨酸螯合鐵組。
