１  胰蛋白酶抑制劑的來源

　　胰蛋白酶抑制劑廣泛存在于豆類、谷類、油料作物等植物中。胰蛋白酶抑制劑在這些作物在各部位均有分布，但主要存在于作物的種子中。在種子內，胰蛋白酶抑制劑主要分布于蛋白質含量豐富的組織或器官，定位于蛋白體、液泡或存在于細胞液中。例如大豆和綠豆種子中胰蛋白酶抑制劑的含量可達總蛋白的6%～8%。在不同作物種子中，胰蛋白酶抑制劑鐵活性各不相同。通常以大豆中胰蛋白酶抑制活性最高。

　　在禽類的蛋清中存在兩種蛋白酶抑制劑――卵類粘蛋白和卵清蛋白酶抑制。卵類粘蛋白可抑制豬、羊和牛的胰蛋白酶的活性，但對人的胰蛋白酶活性無抑制作用。卵清蛋白酶抑制劑可抑制牛和羊的胰蛋白酶及糜蛋折酶的活性。它們的存在可以防止蛋白質的分解，阻止細菌在蛋中繁殖，因而具有保護蛋黃和卵胚的作用。它們也是攝食生禽蛋后不易消化和易引起腹瀉的原因。

２  胰蛋白酶抑制劑的生物化學性質

2.1  大豆胰蛋白酶抑制劑的分子量較小（通常低于50 000）的、具有生理活性的功能性蛋白質。目前研究得最多的是大豆胰蛋白酶抑制劑（soybean trypsin inhibitor,STI），它根據氨基酸序列同源性可分為以下兩類：

2.1.1  Kunitz類抑制劑（Kunitz trypsin inhibitor，KTI）

   此類抑制劑由Kunitz（1945）首次從大豆中分離并結晶出來,因此而命名。這類抑制的分子量為20 000～25 000，由181個氨基酸和２個二硫鍵組成，活性中心（即直接參與和胰蛋白酶相互作用的部位）位于第63個氨基酸（精氨酸）和第64個氨基酸（異亮氨酸）之間。由于分子內只有一個活性中心，因而又被叫做單頭（single-headed）抑制劑，主要對胰蛋白酶直接地、專一地起作用。這類抑制劑與胰蛋白酶的結合是定量地進行的，即１g分子（mol）的抑制劑可以結合lg分子(mol)的胰蛋白酶.

2.1.2  Bowman-Birk類抑制劑(Bowman-Birk in-hibitor,BBI)

　　此類抑制劑是因為Bowman(1994)首先從大豆中分離并由Birk(1961)鑒定而得名.這類抑制劑的分子量為6000～10000，由71個氨基酸組成,含有7個二硫鍵。它有兩個活性中心，分別位于第16個氨基酸(賴氨酸)和第43個氨基酸(亮氨酸)與第44個氨基酸(絲氨酸)之間,可分別與胰蛋白酸和糜蛋白酶結合。由于抑制劑分子內有兩個活性中心，故被稱為雙頭（double-headeb）抑制劑。

　　Kunitz類和Bowman-Birk類抑制劑是大豆中最主要的兩類胰蛋白酶抑制劑，它們在大豆中的含量分別為1.4%和0.6%。這兩類胰蛋白酶抑制劑對熱、酸、堿的穩定性有所差異。純化的Kunitz類抑制劑在30℃以下溫度和pH值1～2范圍內保持其活性。在80℃短時間加熱能使它可逆地變性，而在90℃加熱則使它不可逆地失活。Bowman-Birk類抑制劑比Kunitz類抑制劑對熱、酸、堿的穩定性強。當在干燥狀態、105℃加熱或用其0.02%水溶液在100℃加熱10min,仍可保存它們的活性(Fennema ,1980).關于它們對熱的穩定性也右相反的報道,認為BBI比KTI對熱更不穩定(Dipietro和Liener,1989)。

2.2  胰蛋白酶抑制劑與靶酶的反應機理

　　大豆中的胰蛋白酶抑制劑屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑.它可以和胰腺分泌的絲氨酸蛋白酶系(如胰蛋白酶、糜蛋白酶等)發生反應。胰蛋白酶抑制劑與其靶酶的相互作用，通常如酶與底物之間的相互作用一樣，屬于互補型作用機理。兩者反應時，抑制劑暴露在外的活性中心與靶酶的活性中心通過氫鍵相連接，形成穩定的共價型復合物，從而導致酶活性中心的閉鎖，使靶酶的活性喪失。兩者之間的反應用化學方程式表示為：

　　蛋白酶+抑制劑=蛋白酶與抑制劑復合物=蛋白酶+變性的抑制劑(Laskowski等，1980；Gueguen等,1993)

　　與通常的酶催化反應相比,蛋白酶與抑制劑之間反應的米氏常數(Km)很低,故蛋白酶與抑制劑的親和力大,二者可以迅速結合形成復合物.與一般酶的底物不同,抑制劑與酶結合形成復合物.與一般酶的底物不同,抑制劑與酶結合后期活性中心的肽鍵并不裂解或裂解速度極慢。因此，該復合物雖然可以分       解成游離的酶和變性或未變性的抑制劑，但解離速度非常緩慢。

　　以上說明抑制劑從某種意義上講可看作是酶的底物（作用物），其與酶的接觸部位主要集中于抑制劑活性中心（反應位點）附近的氨基酸殘基。Sweet等（1974）和Laskowski等(1971)分別列出了大豆KTI和BBI活性中心附近的氨基酸序列(表1)

表1　大豆胰蛋白酶抑制劑反應位點(↓)附近的氨基酸序列

注：1．Sweet等,1974;

2．Laskowski等，1971

３  胰蛋白酶抑制劑的有害作用

　　胰蛋白酶抑制劑對動物的有害作用主要是引起生長抑制和使某些動物引起胰腺肥大。胰蛋白酶抑制劑對動物生長產生抑制作用，一般認為有以下兩方面的原因：

3.1  胰蛋白酶抑制劑能和小腸中的胰蛋白酶及糜蛋白酶結合,形成穩定的復合物,使酶失活,導致食物蛋白質的消化率降低,引起外源性氮的損失.

3.2  胰蛋白酶抑制劑可引起胰腺分泌活動增強,導致胰蛋白酶和糜蛋白酶的過度分泌.由于這些蛋白酶含有非常豐富的含硫氨基酸,所以使用于合成體組織蛋白的這些氨基酸轉而用于合成蛋白酶,并與抑制劑形成復合物而最終通過糞便排出體外,從而導致內源性氮和機體含硫氨基酸的大量損失.大豆蛋白質本來就缺乏含硫氨基酸,加上抑制劑所引起的含硫氨基酸的額外損失,導致體內氨基酸代謝不平衡,因而阻礙了動物的生長.有研究認為,攝入含有蛋白酶抑制劑的日糧時,通過含硫氨基酸的內源性損失對機體氮平衡的影響,比通過日糧中氨基酸的損失(外源性損失)所致的影響要大(Barth等,1994).

　　關于胰蛋白酶抑制劑引起含硫氨基酸內源性損失的機理,一般認為,胰腺體細胞分泌蛋白泉水解酶原(包括胰蛋白酶原、糜蛋白酶原等)是受膽囊收縮素－促胰酶素（Cholecystokinin-pancreozymin，縮寫CCK-PZ）調節的。CCK-PZ是十二指腸和空腸粘膜的內分泌細胞(Ⅰ細胞)分泌的一種肽類激素。CCK-PZ的分泌和小腸中胰蛋白酶及糜蛋白酶的數量之間存在負反饋性調節機制。當小腸中胰蛋白酶及糜蛋白酶和食入的胰蛋白酶抑制劑結合后，在腸道內酶的含量降到一定程度時，CCK-PZ的分泌即增加，從而剌激胰腺分泌更多的胰蛋白酶原和糜蛋白酶原至腸道中。由于這些酶的大量分泌，因而造成體內含硫氨基酸的內源性損失。

　　胰蛋白酶抑制劑引起動物胰腺肥大的機理至今尚未完全弄清。一般認為，由于CCK-PZ的分泌增加,因而促使胰腺的分泌過度增加,使胰腺外分泌組織細胞的體積增加和數量增多,從而引起胰腺代償性并未相起胰腺肥大(Schneeman，1986)。有人認為，不同種類動物胰腺的相對重量與它們對胰蛋白酶抑制劑反應的敏感性的相對似乎有直接關系。據報道，胰腺的重量超過體重0.3%的動物(如豬、犢牛)則不出現胰腺肥大（表２）

表2　不同動物胰腺相對重量與大豆TI引起的胰腺肥大效應間的關系

　　大豆胰蛋白酶抑制劑對人體胰蛋白酶的抑制作用，報道較少。一般認為它對人體胰蛋白酶活性只有部分抑制作用。Krogdahl和Holm（1981）指出,人食入大豆后,在胃液中KTI即被滅活,但BBI仍能保持其活力.

　　關于胰蛋白酶抑制劑對動物的致癌性與抗癌作用問題,目前報道結果不一。有人報道，某些動物胰腺瘤的發生與日糧中胰蛋白酶抑制劑的活性呈正相關（Morgan等，1977；Gumbmann 等，1989）。但有一些研究抑制劑甚至有降低癌癥發生率的作用（Liener 和Hasdai,1986;Messia和Ende,1995）。

　　關于反芻動物瘤中微生物能否消除豆類中胰蛋白酶抑制劑的活性，報道結果不一致。有試驗表明，大豆KTI在瘤胃內可很快地被瘤胃微生物降解而失活（Baintner，1981）。Holmes等(1993)報道，在綿羊瘤胃液中加入７種粉碎的豆類作物， 12h～18h后，胰蛋白酶抑制劑的活性仍無明顯變化。

　　此外，近年研究還發現豆類植物種子的胰蛋白酶抑制劑也是α－淀粉酶的抑制劑(Hudson,1984) 。

４  飼料中胰蛋白酶抑制劑的去除

4.1　 熱處理法

　　胰蛋白酶抑制劑本身為蛋白質或蛋白質的結合體,對熱不穩定,充分加熱可使之變性失活,從而消除其有害作用。胰蛋白酶抑制劑受加熱處理而失活的程度與加熱的溫度、時間、飼料粒度大小和水分含量等因素有關。

　　用預榨浸出去、壓榨法生產的大豆餅粕，由于在加工過程中有較充分的加熱，可使胰蛋白酶抑制劑失活，有害作用大大減弱或消除。溶劑浸提法或一些土法、冷榨法生產的大豆餅粕，由于加熱不充分，其中仍含有相當量的胰蛋白酶抑制劑，其營養價值大為降低，因而用于雞和豬的飼料時還應經過加熱鈍化處理。

　　生大豆中胰蛋白酶的含量高，用于豬、雞飼糧時應先進行加熱處理。生大豆對反芻動物雖無不良影響，但用加熱處理過的大豆飼喂反芻動物時，可提高其產乳量和生長率。

　　大豆及生豆粕的加熱處理方法有煮、蒸汽處理（常壓或高壓蒸汽）、烘烤、紅外輻射處理、微波輻射處理、擠壓膨化（干法或濕法擠壓膨化）等。濕法加熱（蒸汽、煮等）的效果一般優于干法加熱（烘烤、紅外輻射等）。通常采用常壓蒸汽加熱30min，或98kPa壓力的蒸汽處理15min～20min，可使胰蛋白酶抑制劑失活。此外，擠奈膨化的效果也比較好。

　　大豆及豆粕的加熱程度對其營養品質影響很大。加熱不足，胰蛋白酶抑制劑破壞不充分，降低蛋白質的消化率；加熱過度，雖然胰蛋白酶抑制劑已失活，但分使蛋白質發生變性，溶解度降低，特別是引起賴氨酸、精氨酸和胱氨酸的破壞或消化率降低。

　　為了評價大豆及豆粕加熱的程度，從而判斷大豆與豆粕中胰蛋白酶抑制劑的破壞程度及其營養價值，可采用多種評價方法與指標，如胰蛋白酶抑制劑活性（trypsin inhibitor activity,TIA）、尿素酶活性（urease activity,UA）、蛋白質溶解度（protein solubility, PS）等。這幾項指標之間存在著明顯的正相關關系，因此測定其中任何一項均可。由于胰蛋白酶抑制劑活性的測定方法較為復雜，故一般不常用。通常多測定尿素酶活性和蛋白質溶解度。

　　大豆及豆粕中存在的胰蛋白酶抑制劑和尿素酶的本質都是水溶性蛋白質，它們經加熱處理時會失去活性。尿素酶經加熱而失活的速率與胰蛋白酶抑制劑大致相同，且尿素酶活性測定方法簡便，因此生產實踐中通常采用尿素酶活性的測定來反映大豆及豆粕加熱是否足夠的指標。尿素酶活性高，表明大豆或豆粕加熱不足，其中胰蛋白酶抑制劑的活性高；尿素酶活性低，表明加熱充分，其所含的蛋白酶抑制劑已大多被滅活。大豆及豆粕中尿素酶活性應處于合適的范圍，基允許量標準，不同國家和地區的規定不盡一致，而且由于測定方法的不同，允許量的數值及表示單位也有所不同。我國制定的《大豆制品中尿素酶活性測定方法》標準（GB8622-88）是以每分鐘每克大豆制品釋放的氨態氮的毫克數(Nmg/g·min)來表示尿素酶活性。我國《飼料用大豆》標準（GB10384-89）規定：“飼料用大豆需加熱后使用，尿素酶活性不得超過0.4”。我國《飼料用大豆餅》標準（GB10379-89）和《飼料用大豆粕》標準（GB10380-89）規定,大豆餅和大豆粕的尿素酶活性都不得超過0.4。但在生產實踐中，人們通常采用pH增值法測定尿素酶活性。該法是以pH值的上升值(△pH)來表示尿素酶活性。一般認為，飼料用大豆餅、粕和加熱后的飼料用大豆，其尿素酶活性的最適范圍為0.05～0.20△pH，最高不超過0.5△pH。但不同國家和地區的標準略有差異。如美國大豆粕質量標準中，尿素酶活性規定為0.05～0.20△pH；巴西為0.01～0.3△pH；多數國家規定為0.05～0.5△pH。臺灣省標準為0.02～0.3△pH。

　　蛋白質溶解度（PS）一般作為判定大豆及豆粕是否加熱過度的指標,即當尿素酶活性因過度加熱而降為0時,用蛋白質溶解度仍可評價過度加熱的豆粕的品質。大豆加熱溫度的升高和時間的延長，大豆蛋白會不同程度地發生變性，其溶解度降低。因此，通過測定大豆及豆粕的蛋白質溶解度。可反映出熱處理過程中大豆蛋白的性程度。如果加工過程中熱處理溫度太高或時間延長，大部分蛋白質發生變性，溶解度降低，表明大豆及豆粕的營養價值下降。一般要求蛋白質溶解度（0.2%KOH溶液）應在70%～85%之間。PS＞85%時，表示加熱不足，PS＜70%時則表示加熱過度(Dale,1990)。

4.2  化學處理法

　　一些研究表明,大豆中的胰蛋白酶抑制劑可以通過化學處理方法使其滅活。此類方法的作用機理一般都是利用化學物質破壞胰蛋白抑制劑的二硫鍵，從而改變胰蛋白酶抑制劑分子結構以達到滅活的目的。已采用過的化學物質（或稱化學鈍化劑）有亞硫酸鈉（Na₂SO₃）、偏重亞硫酸鈉（Na₂S₅O₃）、硫酸銅、硫酸亞鐵、硫代硫酸鈉、戊二醛以及一些帶硫醇基的化合物（胱氨酸、N-乙酰胱氨酸）等。候水生等（1994）報道,采用0.5%偏重亞硫酸鈉（Na₂S₂O₅）、處理生豆粕1周以上,可使胰蛋白酶抑制劑降低59.83%。

4.3 酶處理法

　　國外有人研究用某些真菌和細菌的菌株所產的特異性酶來來活大豆中的胰蛋白酶抑制劑,有一定的效果(Meijer和Spekking，1993;Huo等,1993)。國內近年有人用枯草桿菌蛋白酶對脫脂大豆粉進行水解，結果表明枯草桿菌蛋白酶可以水解去除脫脂大豆粉中所含的胰蛋白酶抑制劑，但存在的總是是同時將大豆中其它蛋白質也進行了水解（陳中等，2000）因此，用外源酶制劑來滅活大豆等豆類籽實中的胰蛋白酶抑制劑的處理方法目前仍處于研究階段，尚未應用于生產，但它是一個有前途的方法。

4.4  作物育種方法

　　國內外對大豆Ti基因(不含胰蛋白酶抑制劑的隱性基因)及其遺傳規律的研究,為通過作物育種手段降低大豆胰蛋白酶抑制劑的活性提供了依據。Hymowitz于1986年已成功地培育出了低胰蛋白酶抑制劑的大豆新品種,其胰蛋白酶抑劑的活性比一般大豆低50%。