關(guān)鍵詞 格氏乳酸桿菌；生物學(xué)特性；發(fā)酵參數(shù)；存活率
乳酸桿菌是豬消化道前段的優(yōu)勢菌群（Ewing和 Cole，1994），能抑制腸道腐敗菌活動，乳酸桿菌產(chǎn)生的乳酸能夠降低pH值，抑制其它微生物生長（康 白，1988），消化道中乳酸桿菌的數(shù)量、種類和位置對于預(yù)防和控制疾病具有重要作用（Fuller，1989）。乳酸桿菌在胃腸道內(nèi)能夠產(chǎn)生細菌素，抑制病原菌的作用，而且乳酸桿菌屬的細菌都是無毒副作用的，因此是一類很有前途的益生素生產(chǎn)菌種（Ewing和Cole，1994）。在美國，益生素工業(yè)上應(yīng)用的產(chǎn)品57%含有乳酸桿菌屬（李 玲，1995）。國內(nèi)對乳酸桿菌作為益生素的飼養(yǎng)試驗結(jié)果報道較多，而對菌種的生物學(xué)特性研究較少，尤其對格氏乳酸桿菌的生物學(xué)特性的研究則未見報道。該菌雖未列入GRAS菌種，但已作為一種人用的益生素菌種在實際中應(yīng)用。對其進行的研究主要集中在其對胃腸道黏膜的粘附和抑菌作用的分子機理。益生菌的生物學(xué)特性對菌種的發(fā)酵生產(chǎn)和進一步研究其在胃腸道的生長繁殖特性具有重要意義，本試驗的目的是系統(tǒng)地研究了一株仔豬胃源格氏乳酸桿菌的生長曲線、抗逆特性（耐酸、耐熱和貯藏存活率）和發(fā)酵參數(shù)，為生產(chǎn)發(fā)酵該菌株提供有用的數(shù)據(jù)。
1 材料與方法
1.1 生長曲線
MRS肉湯：蛋白胨10g；牛肉浸膏10g；酵母浸粉5g；磷酸氫二鉀2g；枸椽酸二銨2g；葡萄糖20g；七水硫酸鎂0.58g；四水硫酸錳0.25g；醋酸鈉5g；蒸餾水1 000ml，在500ml錐形瓶里裝300ml MRS肉湯。按1%接種量接種格氏乳酸桿菌培養(yǎng)物，在前24h每隔1h，24h 之后在第28、32、36、40、44、48h取樣，取1ml培養(yǎng)液進行梯度稀釋后，在10-2～10-6稀釋度取0.3ml稀釋液在MRS瓊脂（pH5.2）上均勻涂布，每個梯度做3個平行樣，平皿放置在37℃， 5%CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h，取平皿中的菌落數(shù)50～150的稀釋度作為計算用，每個梯度做3個平行樣，以平均值表示結(jié)果。每毫升細菌濃度以對數(shù)值表示。
1.2 耐酸存活率
MRS肉湯：蛋白胨10g；牛肉浸膏10g；酵母浸粉5g；磷酸氫二鉀2g；枸椽酸二銨2g；葡萄糖20g；七水硫酸鎂0.58g；四水硫酸錳0.25g；醋酸鈉5g；吐溫-80 1g；蒸餾水1 000ml；用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至5.4，再用濃鹽酸將pH調(diào)節(jié)至2.0。置于Hungates滾管中，每個管裝20ml肉湯，制成厭氧無菌肉湯。涼下來后每管中加1ml格氏乳酸桿菌16h的培養(yǎng)物，在開始時、2h、4h、6h和8h分別取樣，測定存活率。用無菌注射器取出1ml進行梯度稀釋后，在10-4～10-7稀釋度取0.3ml稀釋液在MRS瓊脂（pH5.2）上均勻涂布，每個梯度做3個平行樣，平皿放置在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h，取平皿中的菌落數(shù)50～150的平皿計數(shù)，以平均值表示結(jié)果。
存活率的計算公式為：
S酸= nx / n0
式中：S酸——經(jīng)過pH2.0處理后不同時間的格氏乳酸桿菌存活率；
n0——pH2.0處理前每毫升活菌數(shù)；
nx——pH2.0處理2、4、6、8 h后每毫升活菌數(shù)。
1.3 耐熱存活率
MRS肉湯：蛋白胨10g；牛肉浸膏10g；酵母浸粉5g；磷酸氫二鉀2g；枸椽酸二銨2g；葡萄糖20g；七水硫酸鎂0.58g；四水硫酸錳0.25g；醋酸鈉5g；吐溫-80 1g；蒸餾水1 000 ml；調(diào)節(jié)pH為6.7，置于Hungates滾管中，每個管裝20ml肉湯，制成厭氧無菌肉湯。每管中加1ml格氏乳酸桿菌培養(yǎng)16h后的培養(yǎng)物，放置在37℃培養(yǎng)箱中16h后，取樣進行活菌計數(shù)培養(yǎng)，同時將Hungates管迅速放置在75℃水浴中加熱15 min，取樣進行活菌計數(shù)。用無菌注射器取出1ml進行梯度稀釋后，在10-4～10-7稀釋度取0.3ml稀釋液在MRS瓊脂（pH5.2）上均勻涂布，每個梯度做3個平行樣，平皿放置在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h，取平皿中的菌落數(shù)為50～150的平皿計數(shù)，以平均值表示結(jié)果。
存活率的計算公式為：
S熱= n1 / n0
式中：S熱——經(jīng)過75℃處理后的格氏乳酸桿菌存活率；
n0——加熱處理前每毫升活菌數(shù)；
n1——加熱處理15min后每毫升活菌數(shù)。
1.4 貯藏存活率
MRS肉湯：蛋白胨10g；牛肉浸膏10g；酵母浸粉5g；磷酸氫二鉀2g；枸椽酸二銨2g；葡萄糖20g；七水硫酸鎂0.58g；四水硫酸錳0.25g；醋酸鈉5g；吐溫-80 1g；蒸餾水1 000ml；pH為6.7，置于Hungates滾管中，每個管放置20ml的MRS肉湯，制成厭氧無菌肉湯后，每管中加1ml格氏乳酸桿菌培養(yǎng)16h的培養(yǎng)物，放置在37℃培養(yǎng)箱中16h后，取樣1ml進行活菌計數(shù)。室溫下放置1個月后，取樣1ml進行活菌計數(shù)培養(yǎng)。計數(shù)方法用無菌注射器取出1ml進行梯度稀釋后，在10-4～10-7稀釋度取0.3ml稀釋液在MRS瓊脂（pH5.2）上均勻涂布，每個梯度做3個平行樣，平皿放置在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h，取菌落數(shù)為50～150個的平皿計數(shù)，以平均值表示結(jié)果。
存活率的計算公式為：
S貯= n1 / n0
式中：S貯——經(jīng)過1個月貯藏后的格氏乳酸桿菌存活率；
n0——貯藏前每毫升活菌數(shù)；
n1——貯藏1個月后每毫升活菌數(shù)。
1.5 發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化
采用均勻設(shè)計方法對6個影響格氏乳酸桿菌發(fā)酵的因素進行優(yōu)化，試驗按照6因素6水平均勻設(shè)計表進行安排，組成6種發(fā)酵參數(shù)方案，培養(yǎng)基的微量元素含量按照MRS肉湯的推薦量添加。試驗處理見表1，每個處理設(shè)3個重復(fù)。每種培養(yǎng)基用1 000ml錐形瓶裝600ml培養(yǎng)基，按5%接種量接種乳酸桿菌培養(yǎng)物，放置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。接種24h之后，取樣測定不同培養(yǎng)基中的活菌濃度，活菌的測定采用厭氧滾管法，在試驗結(jié)束時，每種培養(yǎng)基取出1ml培養(yǎng)液進行梯度稀釋后，在10-4～10-8稀釋度取0.3ml稀釋液注入Hungates滾管中，輕輕搖勻，培養(yǎng)24h后，取菌落數(shù)為50～150的管計算，每個稀釋度做3個平行樣，以平均值表示結(jié)果。
1.6 統(tǒng)計方法
發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化采用中國均勻設(shè)計學(xué)會與香港浸會大學(xué)統(tǒng)計學(xué)研究和咨詢中心共同開發(fā)的均勻設(shè)計軟件4.0版，統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，用二次回歸和逐步回歸的方法對各因素的解進行最優(yōu)化。
2 結(jié)果與討論
2.1 生長曲線
生長曲線主要反映一種微生物的生長特性，典型的微生物生長模型一般要經(jīng)歷延遲期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰亡期4個階段。延遲期是微生物對新的生長環(huán)境的適應(yīng)過程，在這一過程中，微生物表現(xiàn)為數(shù)量不變或下降，微生物對其自身的大分子和小分子的組成進行調(diào)整，同時也會產(chǎn)生特定的物質(zhì)如酶等來適應(yīng)新的環(huán)境。對數(shù)生長期是微生物對新的環(huán)境適應(yīng)之后，菌體生長繁殖速度呈幾何級數(shù)的階段，是菌體數(shù)量增長最快的一個階段，表現(xiàn)為菌體數(shù)量增加，菌體重量增加。但是到了對數(shù)期的末期，由于細菌的生長營養(yǎng)物質(zhì)消耗以及細菌正常生理代謝產(chǎn)物的積累，細菌的生長繁殖速率下降。穩(wěn)定期是細菌生長速率與死亡速率趨于平衡的階段。衰亡期細菌數(shù)明顯下降。格氏乳酸桿菌的生長曲線如圖1所示，從圖1可見，格氏乳酸桿菌的濃度從104個數(shù)量級經(jīng)過14h的培養(yǎng)迅速上升到1010個數(shù)量級，到48h，細菌的數(shù)量級沒有變化，只是活菌數(shù)有下降的趨勢，主要原因是培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)濃度下降，培養(yǎng)基中有害代謝產(chǎn)物增加引起菌體死亡，生長繁殖的菌體數(shù)量比死亡的菌體數(shù)量更多，導(dǎo)致總的活菌數(shù)量減少。益生菌產(chǎn)品的活菌數(shù)普遍偏低，在美國有一項調(diào)查表明81%的益生素產(chǎn)品活菌數(shù)比標簽上聲明的數(shù)量要低得多（Fuller，1999），可能的原因之一是一些廠家為了降低生產(chǎn)成本，在制造時就沒有按要求達到所規(guī)定的活菌數(shù)。從生長曲線可以看出，格氏乳酸桿菌的最佳收獲期在培養(yǎng)后14～24h。在這一段時間收獲菌體，可以減少獲得單位活菌的成本。
2.2 耐酸存活率
成年豬的胃pH值一般為1～2，斷奶仔豬胃的pH值變異較大，一般為2.60～5.83（楊 琳等，2001），胃環(huán)境對細菌的破壞是pH依賴的酸水解作用，pH小于2.5時殺菌作用很明顯，胃是動物消除進入體內(nèi)病原微生物的第一道屏障， 當然正是這種胃的酸性環(huán)境對進入體內(nèi)的有益微生物的活力會產(chǎn)生不利的影響。本試驗在體外模擬仔豬胃內(nèi)的酸度， 考慮到斷奶仔豬胃內(nèi)還有其它的抑菌因素， 采用比正常斷奶仔豬胃內(nèi)更低的酸度pH2.0的培養(yǎng)液測定不同處理時間格氏乳酸桿菌的活菌濃度，不同處理時間的活菌濃度見表2。
從表2可見，在pH2.0處理的前4h，格氏乳酸桿菌還有一定的生長，說明格氏乳酸桿菌的耐酸性能較好，但到了第6h活菌數(shù)開始下降，但也比起始活菌數(shù)高，只是到了第8h，活菌數(shù)才呈急劇的下降，與細菌的大量死亡有關(guān)。格氏乳酸桿菌是一株分離自斷奶仔豬胃粘膜上皮細胞的乳酸桿菌，在仔豬飼料中添加的預(yù)期目標也是使其能夠被仔豬攝食后在胃內(nèi)定植、生長和繁殖，從而發(fā)揮抑制病原菌的益生作用。仔豬胃部的pH值范圍一般為2.60～5.83，這說明格氏乳酸桿菌對胃的低pH環(huán)境完全可以耐受而且數(shù)量還可以有一定的增加。尤其是當胃部的pH值因斷奶而上升時，格氏乳酸桿菌的生長速率勢必加快，胃內(nèi)格氏乳酸桿菌增加有利于保持胃內(nèi)微生物菌群的平衡，形成正常的微生物菌群對抑制病原菌的繁殖和在胃粘膜的粘附具有重要作用，同時乳酸桿菌分泌的乳酸對降低胃內(nèi)pH也有一定的補充作用，這對提高仔豬胃制病原菌的能力、提高胃蛋白酶原的活化和胃蛋白酶的活力將有很大益處。
2.3 耐熱存活率
格氏乳酸桿菌經(jīng)過75℃處理15min后的活菌濃度如下：
處理前：5.7×109CFU/ml，75℃處理后4.1×109 CFU/ml，存活率為72%。一般仔豬飼料的調(diào)質(zhì)和制粒溫度為70～85℃之間，飼料在調(diào)質(zhì)腔和制粒機內(nèi)總的時間為25～30s，格氏乳酸桿菌經(jīng)過75℃之后存活率能達到72%，說明這一株乳酸桿菌在飼料制粒時可以耐受制粒時的高溫，作為飼料添加劑將會有很好的前途。這個存活率也比前人報道的高很多倍，許多報道乳酸桿菌經(jīng)過70℃以上的高溫處理之后，存活率幾乎為零。而且耐高溫之后存活率低也是乳酸桿菌作為飼料添加劑的主要限制性因素之一。從本試驗的結(jié)果看格氏乳酸桿菌的耐熱性能是良好的。
2.4 貯藏存活率
格氏乳酸桿菌的起始活菌濃度為每毫升4.5×1010CFU，經(jīng)過一月之后活菌濃度為每毫升1.7×1010CFU，貯藏存活率為37.8%。從本試驗的結(jié)果看，含有該菌株的益生素產(chǎn)品在體外的貯藏時間不宜太長，最好在一個月之內(nèi)使用完。一般的預(yù)混料的保質(zhì)期是3～4個月，使用格氏乳酸桿菌的益生素產(chǎn)品應(yīng)標明適當?shù)谋Ｙ|(zhì)期，以保證仔豬在采食時能攝入足夠數(shù)量的活菌。
2.5 發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化
本試驗考慮的影響格氏乳酸桿菌生長繁殖較大的因素主要有時間、碳源如葡萄糖和蔗糖、氮源有胰蛋白胨和檸檬酸銨以及生長促進物質(zhì)酵母浸粉，優(yōu)化的組分主要以MRS培養(yǎng)基的組成成分為基準。試驗結(jié)果見表3，從表3可見，用均勻設(shè)計法安排的6種不同發(fā)酵方案對格氏乳酸桿菌的活菌濃度有明顯的影響。試驗結(jié)果采用均勻設(shè)計軟件4.0版中的二次回歸和逐步回歸的方法對各因素的解進行最優(yōu)化，同時對不同影響因素之間的相關(guān)系數(shù)也進行了考察，不同影響因素的相關(guān)系數(shù)見表4，優(yōu)化結(jié)果見表5。從表4可以看出，時間、葡萄糖和胰蛋白胨對格氏乳酸桿菌的生長具有正面效應(yīng)，而檸檬酸銨、酵母浸粉和蔗糖則呈現(xiàn)負效應(yīng)，尤其是檸檬酸銨，在濃度高時對提高格氏乳酸桿菌的生長量是不利的。葡萄糖和蔗糖、胰蛋白胨有一定的協(xié)同作用，而和酵母浸粉、檸檬酸銨有拮抗作用，葡萄糖濃度高時，延長發(fā)酵時間對菌體濃度是不利的。從表5可以看出格氏乳酸桿菌的發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化組成，為今后的發(fā)酵生產(chǎn)提供了一套重要的數(shù)據(jù)。
3 小結(jié)
格氏乳酸桿菌在發(fā)酵后14～24h是合適的菌體收獲期；格氏乳酸桿菌的耐熱存活率為72%，耐貯藏存活率為37.8%，耐酸存活率為133%；不同氮源對格氏乳酸桿菌的發(fā)酵活菌濃度影響較大，胰蛋白胨對其活菌濃度有正效應(yīng)，而銨鹽對其生長有負效應(yīng)。優(yōu)化后的發(fā)酵參數(shù)為：時間，20h；葡萄糖，110g/l；蔗糖，60g/l；胰蛋白胨，30g/l；酵母浸粉，30g/l；檸檬酸銨，2g/l。
參考文獻（略）
