摘 要 試驗研究了一株從斷奶后健康的仔豬胃粘膜分離到的格氏乳酸桿菌（Lactobacillus gasseri）的一些重要生物學特性。在體外研究了格氏乳酸桿菌的生長曲線、耐酸存活率、耐熱存活率、貯藏存活率等，同時采用均勻設計法優化發酵參數。結果表明，格氏乳酸桿菌的活菌濃度從開始的104 CFU/ml經過14h的培養迅速上升到1010 CFU/ml，到48h以后，細菌活菌濃度的數量級沒有變化，但活菌濃度呈下降的趨勢。pH2.0處理6h后的存活率為133%，75℃處理15min之后存活率為72%，經過一個月貯藏存活率為37.8%，優化的發酵參數為：時間20h，葡萄糖110g/l，蔗糖60g/l，胰蛋白胨30g/l，酵母浸粉30g/l，檸檬酸銨2g/l。
乳酸桿菌是豬消化道前段的優勢菌群（Ewing和 Cole，1994），能抑制腸道腐敗菌活動，乳酸桿菌產生的乳酸能夠降低pH值，抑制其它微生物生長（康 白，1988），消化道中乳酸桿菌的數量、種類和位置對于預防和控制疾病具有重要作用（Fuller，1989）。乳酸桿菌在胃腸道內能夠產生細菌素，抑制病原菌的作用，而且乳酸桿菌屬的細菌都是無毒副作用的，因此是一類很有前途的益生素生產菌種（Ewing和Cole，1994）。在美國，益生素工業上應用的產品57%含有乳酸桿菌屬（李 玲，1995）。國內對乳酸桿菌作為益生素的飼養試驗結果報道較多，而對菌種的生物學特性研究較少，尤其對格氏乳酸桿菌的生物學特性的研究則未見報道。該菌雖未列入GRAS菌種，但已作為一種人用的益生素菌種在實際中應用。對其進行的研究主要集中在其對胃腸道黏膜的粘附和抑菌作用的分子機理。益生菌的生物學特性對菌種的發酵生產和進一步研究其在胃腸道的生長繁殖特性具有重要意義，本試驗的目的是系統地研究了一株仔豬胃源格氏乳酸桿菌的生長曲線、抗逆特性（耐酸、耐熱和貯藏存活率）和發酵參數，為生產發酵該菌株提供有用的數據。
1 材料與方法
1.1 生長曲線
MRS肉湯：蛋白胨10g；牛肉浸膏10g；酵母浸粉5g；磷酸氫二鉀2g；枸椽酸二銨2g；葡萄糖20g；七水硫酸鎂0.58g；四水硫酸錳0.25g；醋酸鈉5g；蒸餾水1 000ml，在500ml錐形瓶里裝300ml MRS肉湯。按1%接種量接種格氏乳酸桿菌培養物，在前24h每隔1h，24h 之后在第28、32、36、40、44、48h取樣，取1ml培養液進行梯度稀釋后，在10-2～10-6稀釋度取0.3ml稀釋液在MRS瓊脂（pH5.2）上均勻涂布，每個梯度做3個平行樣，平皿放置在37℃， 5%CO2的培養箱中，培養24h，取平皿中的菌落數50～150的稀釋度作為計算用，每個梯度做3個平行樣，以平均值表示結果。每毫升細菌濃度以對數值表示。
1.2 耐酸存活率
MRS肉湯：蛋白胨10g；牛肉浸膏10g；酵母浸粉5g；磷酸氫二鉀2g；枸椽酸二銨2g；葡萄糖20g；七水硫酸鎂0.58g；四水硫酸錳0.25g；醋酸鈉5g；吐溫-80 1g；蒸餾水1 000ml；用冰醋酸調節pH至5.4，再用濃鹽酸將pH調節至2.0。置于Hungates滾管中，每個管裝20ml肉湯，制成厭氧無菌肉湯。涼下來后每管中加1ml格氏乳酸桿菌16h的培養物，在開始時、2h、4h、6h和8h分別取樣，測定存活率。用無菌注射器取出1ml進行梯度稀釋后，在10-4～10-7稀釋度取0.3ml稀釋液在MRS瓊脂（pH5.2）上均勻涂布，每個梯度做3個平行樣，平皿放置在37℃，5%CO2的培養箱中，培養24h，取平皿中的菌落數50～150的平皿計數，以平均值表示結果。
存活率的計算公式為：
S酸= nx / n0
式中：S酸——經過pH2.0處理后不同時間的格氏乳酸桿菌存活率；
n0——pH2.0處理前每毫升活菌數；
nx——pH2.0處理2、4、6、8 h后每毫升活菌數。
1.3 耐熱存活率
MRS肉湯：蛋白胨10g；牛肉浸膏10g；酵母浸粉5g；磷酸氫二鉀2g；枸椽酸二銨2g；葡萄糖20g；七水硫酸鎂0.58g；四水硫酸錳0.25g；醋酸鈉5g；吐溫-80 1g；蒸餾水1 000 ml；調節pH為6.7，置于Hungates滾管中，每個管裝20ml肉湯，制成厭氧無菌肉湯。每管中加1ml格氏乳酸桿菌培養16h后的培養物，放置在37℃培養箱中16h后，取樣進行活菌計數培養，同時將Hungates管迅速放置在75℃水浴中加熱15 min，取樣進行活菌計數。用無菌注射器取出1ml進行梯度稀釋后，在10-4～10-7稀釋度取0.3ml稀釋液在MRS瓊脂（pH5.2）上均勻涂布，每個梯度做3個平行樣，平皿放置在37℃，5%CO2培養箱中，培養24h，取平皿中的菌落數為50～150的平皿計數，以平均值表示結果。
存活率的計算公式為：
S熱= n1 / n0
式中：S熱——經過75℃處理后的格氏乳酸桿菌存活率；
n0——加熱處理前每毫升活菌數；
n1——加熱處理15min后每毫升活菌數。
1.4 貯藏存活率
MRS肉湯：蛋白胨10g；牛肉浸膏10g；酵母浸粉5g；磷酸氫二鉀2g；枸椽酸二銨2g；葡萄糖20g；七水硫酸鎂0.58g；四水硫酸錳0.25g；醋酸鈉5g；吐溫-80 1g；蒸餾水1 000ml；pH為6.7，置于Hungates滾管中，每個管放置20ml的MRS肉湯，制成厭氧無菌肉湯后，每管中加1ml格氏乳酸桿菌培養16h的培養物，放置在37℃培養箱中16h后，取樣1ml進行活菌計數。室溫下放置1個月后，取樣1ml進行活菌計數培養。計數方法用無菌注射器取出1ml進行梯度稀釋后，在10-4～10-7稀釋度取0.3ml稀釋液在MRS瓊脂（pH5.2）上均勻涂布，每個梯度做3個平行樣，平皿放置在37℃，5%CO2的培養箱中，培養24h，取菌落數為50～150個的平皿計數，以平均值表示結果。
存活率的計算公式為：
S貯= n1 / n0
式中：S貯——經過1個月貯藏后的格氏乳酸桿菌存活率；
n0——貯藏前每毫升活菌數；
n1——貯藏1個月后每毫升活菌數。
1.5 發酵參數的優化
采用均勻設計方法對6個影響格氏乳酸桿菌發酵的因素進行優化，試驗按照6因素6水平均勻設計表進行安排，組成6種發酵參數方案，培養基的微量元素含量按照MRS肉湯的推薦量添加。試驗處理見表1，每個處理設3個重復。每種培養基用1 000ml錐形瓶裝600ml培養基，按5%接種量接種乳酸桿菌培養物，放置在37℃、5%CO2培養箱。接種24h之后，取樣測定不同培養基中的活菌濃度，活菌的測定采用厭氧滾管法，在試驗結束時，每種培養基取出1ml培養液進行梯度稀釋后，在10-4～10-8稀釋度取0.3ml稀釋液注入Hungates滾管中，輕輕搖勻，培養24h后，取菌落數為50～150的管計算，每個稀釋度做3個平行樣，以平均值表示結果。
1.6 統計方法
發酵參數的優化采用中國均勻設計學會與香港浸會大學統計學研究和咨詢中心共同開發的均勻設計軟件4.0版，統計分析數據，用二次回歸和逐步回歸的方法對各因素的解進行最優化。
2 結果與討論
2.1 生長曲線
生長曲線主要反映一種微生物的生長特性，典型的微生物生長模型一般要經歷延遲期、對數生長期、穩定期和衰亡期4個階段。延遲期是微生物對新的生長環境的適應過程，在這一過程中，微生物表現為數量不變或下降，微生物對其自身的大分子和小分子的組成進行調整，同時也會產生特定的物質如酶等來適應新的環境。對數生長期是微生物對新的環境適應之后，菌體生長繁殖速度呈幾何級數的階段，是菌體數量增長最快的一個階段，表現為菌體數量增加，菌體重量增加。但是到了對數期的末期，由于細菌的生長營養物質消耗以及細菌正常生理代謝產物的積累，細菌的生長繁殖速率下降。穩定期是細菌生長速率與死亡速率趨于平衡的階段。衰亡期細菌數明顯下降。格氏乳酸桿菌的生長曲線如圖1所示，從圖1可見，格氏乳酸桿菌的濃度從104個數量級經過14h的培養迅速上升到1010個數量級，到48h，細菌的數量級沒有變化，只是活菌數有下降的趨勢，主要原因是培養基營養物質濃度下降，培養基中有害代謝產物增加引起菌體死亡，生長繁殖的菌體數量比死亡的菌體數量更多，導致總的活菌數量減少。益生菌產品的活菌數普遍偏低，在美國有一項調查表明81%的益生素產品活菌數比標簽上聲明的數量要低得多（Fuller，1999），可能的原因之一是一些廠家為了降低生產成本，在制造時就沒有按要求達到所規定的活菌數。從生長曲線可以看出，格氏乳酸桿菌的最佳收獲期在培養后14～24h。在這一段時間收獲菌體，可以減少獲得單位活菌的成本。
2.2 耐酸存活率
成年豬的胃pH值一般為1～2，斷奶仔豬胃的pH值變異較大，一般為2.60～5.83（楊 琳等，2001），胃環境對細菌的破壞是pH依賴的酸水解作用，pH小于2.5時殺菌作用很明顯，胃是動物消除進入體內病原微生物的第一道屏障， 當然正是這種胃的酸性環境對進入體內的有益微生物的活力會產生不利的影響。本試驗在體外模擬仔豬胃內的酸度， 考慮到斷奶仔豬胃內還有其它的抑菌因素， 采用比正常斷奶仔豬胃內更低的酸度pH2.0的培養液測定不同處理時間格氏乳酸桿菌的活菌濃度，不同處理時間的活菌濃度見表2。
從表2可見，在pH2.0處理的前4h，格氏乳酸桿菌還有一定的生長，說明格氏乳酸桿菌的耐酸性能較好，但到了第6h活菌數開始下降，但也比起始活菌數高，只是到了第8h，活菌數才呈急劇的下降，與細菌的大量死亡有關。格氏乳酸桿菌是一株分離自斷奶仔豬胃粘膜上皮細胞的乳酸桿菌，在仔豬飼料中添加的預期目標也是使其能夠被仔豬攝食后在胃內定植、生長和繁殖，從而發揮抑制病原菌的益生作用。仔豬胃部的pH值范圍一般為2.60～5.83，這說明格氏乳酸桿菌對胃的低pH環境完全可以耐受而且數量還可以有一定的增加。尤其是當胃部的pH值因斷奶而上升時，格氏乳酸桿菌的生長速率勢必加快，胃內格氏乳酸桿菌增加有利于保持胃內微生物菌群的平衡，形成正常的微生物菌群對抑制病原菌的繁殖和在胃粘膜的粘附具有重要作用，同時乳酸桿菌分泌的乳酸對降低胃內pH也有一定的補充作用，這對提高仔豬胃抑制病原菌的能力、提高胃蛋白酶原的活化和胃蛋白酶的活力將有很大益處。
2.3 耐熱存活率
格氏乳酸桿菌經過75℃處理15min后的活菌濃度如下：
處理前：5.7×109CFU/ml，75℃處理后4.1×109 CFU/ml，存活率為72%。一般仔豬飼料的調質和制粒溫度為70～85℃之間，飼料在調質腔和制粒機內總的時間為25～30s，格氏乳酸桿菌經過75℃之后存活率能達到72%，說明這一株乳酸桿菌在飼料制粒時可以耐受制粒時的高溫，作為飼料添加劑將會有很好的前途。這個存活率也比前人報道的高很多倍，許多報道乳酸桿菌經過70℃以上的高溫處理之后，存活率幾乎為零。而且耐高溫之后存活率低也是乳酸桿菌作為飼料添加劑的主要限制性因素之一。從本試驗的結果看格氏乳酸桿菌的耐熱性能是良好的。
2.4 貯藏存活率
格氏乳酸桿菌的起始活菌濃度為每毫升4.5×1010CFU，經過一月之后活菌濃度為每毫升1.7×1010CFU，貯藏存活率為37.8%。從本試驗的結果看，含有該菌株的益生素產品在體外的貯藏時間不宜太長，最好在一個月之內使用完。一般的預混料的保質期是3～4個月，使用格氏乳酸桿菌的益生素產品應標明適當的保質期，以保證仔豬在采食時能攝入足夠數量的活菌。
2.5 發酵參數的優化
本試驗考慮的影響格氏乳酸桿菌生長繁殖較大的因素主要有時間、碳源如葡萄糖和蔗糖、氮源有胰蛋白胨和檸檬酸銨以及生長促進物質酵母浸粉，優化的組分主要以MRS培養基的組成成分為基準。試驗結果見表3，從表3可見，用均勻設計法安排的6種不同發酵方案對格氏乳酸桿菌的活菌濃度有明顯的影響。試驗結果采用均勻設計軟件4.0版中的二次回歸和逐步回歸的方法對各因素的解進行最優化，同時對不同影響因素之間的相關系數也進行了考察，不同影響因素的相關系數見表4，優化結果見表5。從表4可以看出，時間、葡萄糖和胰蛋白胨對格氏乳酸桿菌的生長具有正面效應，而檸檬酸銨、酵母浸粉和蔗糖則呈現負效應，尤其是檸檬酸銨，在濃度高時對提高格氏乳酸桿菌的生長量是不利的。葡萄糖和蔗糖、胰蛋白胨有一定的協同作用，而和酵母浸粉、檸檬酸銨有拮抗作用，葡萄糖濃度高時，延長發酵時間對菌體濃度是不利的。從表5可以看出格氏乳酸桿菌的發酵參數的優化組成，為今后的發酵生產提供了一套重要的數據。
3 小結
格氏乳酸桿菌在發酵后14～24h是合適的菌體收獲期；格氏乳酸桿菌的耐熱存活率為72%，耐貯藏存活率為37.8%，耐酸存活率為133%；不同氮源對格氏乳酸桿菌的發酵活菌濃度影響較大，胰蛋白胨對其活菌濃度有正效應，而銨鹽對其生長有負效應。優化后的發酵參數為：時間，20h；葡萄糖，110g/l；蔗糖，60g/l；胰蛋白胨，30g/l；酵母浸粉，30g/l；檸檬酸銨，2g/l。
參考文獻
乳酸桿菌是豬消化道前段的優勢菌群（Ewing和 Cole，1994），能抑制腸道腐敗菌活動，乳酸桿菌產生的乳酸能夠降低pH值，抑制其它微生物生長（康 白，1988），消化道中乳酸桿菌的數量、種類和位置對于預防和控制疾病具有重要作用（Fuller，1989）。乳酸桿菌在胃腸道內能夠產生細菌素，抑制病原菌的作用，而且乳酸桿菌屬的細菌都是無毒副作用的，因此是一類很有前途的益生素生產菌種（Ewing和Cole，1994）。在美國，益生素工業上應用的產品57%含有乳酸桿菌屬（李 玲，1995）。國內對乳酸桿菌作為益生素的飼養試驗結果報道較多，而對菌種的生物學特性研究較少，尤其對格氏乳酸桿菌的生物學特性的研究則未見報道。該菌雖未列入GRAS菌種，但已作為一種人用的益生素菌種在實際中應用。對其進行的研究主要集中在其對胃腸道黏膜的粘附和抑菌作用的分子機理。益生菌的生物學特性對菌種的發酵生產和進一步研究其在胃腸道的生長繁殖特性具有重要意義，本試驗的目的是系統地研究了一株仔豬胃源格氏乳酸桿菌的生長曲線、抗逆特性（耐酸、耐熱和貯藏存活率）和發酵參數，為生產發酵該菌株提供有用的數據。
1 材料與方法
1.1 生長曲線
MRS肉湯：蛋白胨10g；牛肉浸膏10g；酵母浸粉5g；磷酸氫二鉀2g；枸椽酸二銨2g；葡萄糖20g；七水硫酸鎂0.58g；四水硫酸錳0.25g；醋酸鈉5g；蒸餾水1 000ml，在500ml錐形瓶里裝300ml MRS肉湯。按1%接種量接種格氏乳酸桿菌培養物，在前24h每隔1h，24h 之后在第28、32、36、40、44、48h取樣，取1ml培養液進行梯度稀釋后，在10-2～10-6稀釋度取0.3ml稀釋液在MRS瓊脂（pH5.2）上均勻涂布，每個梯度做3個平行樣，平皿放置在37℃， 5%CO2的培養箱中，培養24h，取平皿中的菌落數50～150的稀釋度作為計算用，每個梯度做3個平行樣，以平均值表示結果。每毫升細菌濃度以對數值表示。
1.2 耐酸存活率
MRS肉湯：蛋白胨10g；牛肉浸膏10g；酵母浸粉5g；磷酸氫二鉀2g；枸椽酸二銨2g；葡萄糖20g；七水硫酸鎂0.58g；四水硫酸錳0.25g；醋酸鈉5g；吐溫-80 1g；蒸餾水1 000ml；用冰醋酸調節pH至5.4，再用濃鹽酸將pH調節至2.0。置于Hungates滾管中，每個管裝20ml肉湯，制成厭氧無菌肉湯。涼下來后每管中加1ml格氏乳酸桿菌16h的培養物，在開始時、2h、4h、6h和8h分別取樣，測定存活率。用無菌注射器取出1ml進行梯度稀釋后，在10-4～10-7稀釋度取0.3ml稀釋液在MRS瓊脂（pH5.2）上均勻涂布，每個梯度做3個平行樣，平皿放置在37℃，5%CO2的培養箱中，培養24h，取平皿中的菌落數50～150的平皿計數，以平均值表示結果。
存活率的計算公式為：
S酸= nx / n0
式中：S酸——經過pH2.0處理后不同時間的格氏乳酸桿菌存活率；
n0——pH2.0處理前每毫升活菌數；
nx——pH2.0處理2、4、6、8 h后每毫升活菌數。
1.3 耐熱存活率
MRS肉湯：蛋白胨10g；牛肉浸膏10g；酵母浸粉5g；磷酸氫二鉀2g；枸椽酸二銨2g；葡萄糖20g；七水硫酸鎂0.58g；四水硫酸錳0.25g；醋酸鈉5g；吐溫-80 1g；蒸餾水1 000 ml；調節pH為6.7，置于Hungates滾管中，每個管裝20ml肉湯，制成厭氧無菌肉湯。每管中加1ml格氏乳酸桿菌培養16h后的培養物，放置在37℃培養箱中16h后，取樣進行活菌計數培養，同時將Hungates管迅速放置在75℃水浴中加熱15 min，取樣進行活菌計數。用無菌注射器取出1ml進行梯度稀釋后，在10-4～10-7稀釋度取0.3ml稀釋液在MRS瓊脂（pH5.2）上均勻涂布，每個梯度做3個平行樣，平皿放置在37℃，5%CO2培養箱中，培養24h，取平皿中的菌落數為50～150的平皿計數，以平均值表示結果。
存活率的計算公式為：
S熱= n1 / n0
式中：S熱——經過75℃處理后的格氏乳酸桿菌存活率；
n0——加熱處理前每毫升活菌數；
n1——加熱處理15min后每毫升活菌數。
1.4 貯藏存活率
MRS肉湯：蛋白胨10g；牛肉浸膏10g；酵母浸粉5g；磷酸氫二鉀2g；枸椽酸二銨2g；葡萄糖20g；七水硫酸鎂0.58g；四水硫酸錳0.25g；醋酸鈉5g；吐溫-80 1g；蒸餾水1 000ml；pH為6.7，置于Hungates滾管中，每個管放置20ml的MRS肉湯，制成厭氧無菌肉湯后，每管中加1ml格氏乳酸桿菌培養16h的培養物，放置在37℃培養箱中16h后，取樣1ml進行活菌計數。室溫下放置1個月后，取樣1ml進行活菌計數培養。計數方法用無菌注射器取出1ml進行梯度稀釋后，在10-4～10-7稀釋度取0.3ml稀釋液在MRS瓊脂（pH5.2）上均勻涂布，每個梯度做3個平行樣，平皿放置在37℃，5%CO2的培養箱中，培養24h，取菌落數為50～150個的平皿計數，以平均值表示結果。
存活率的計算公式為：
S貯= n1 / n0
式中：S貯——經過1個月貯藏后的格氏乳酸桿菌存活率；
n0——貯藏前每毫升活菌數；
n1——貯藏1個月后每毫升活菌數。
1.5 發酵參數的優化
采用均勻設計方法對6個影響格氏乳酸桿菌發酵的因素進行優化，試驗按照6因素6水平均勻設計表進行安排，組成6種發酵參數方案，培養基的微量元素含量按照MRS肉湯的推薦量添加。試驗處理見表1，每個處理設3個重復。每種培養基用1 000ml錐形瓶裝600ml培養基，按5%接種量接種乳酸桿菌培養物，放置在37℃、5%CO2培養箱。接種24h之后，取樣測定不同培養基中的活菌濃度，活菌的測定采用厭氧滾管法，在試驗結束時，每種培養基取出1ml培養液進行梯度稀釋后，在10-4～10-8稀釋度取0.3ml稀釋液注入Hungates滾管中，輕輕搖勻，培養24h后，取菌落數為50～150的管計算，每個稀釋度做3個平行樣，以平均值表示結果。
1.6 統計方法
發酵參數的優化采用中國均勻設計學會與香港浸會大學統計學研究和咨詢中心共同開發的均勻設計軟件4.0版，統計分析數據，用二次回歸和逐步回歸的方法對各因素的解進行最優化。
2 結果與討論
2.1 生長曲線
生長曲線主要反映一種微生物的生長特性，典型的微生物生長模型一般要經歷延遲期、對數生長期、穩定期和衰亡期4個階段。延遲期是微生物對新的生長環境的適應過程，在這一過程中，微生物表現為數量不變或下降，微生物對其自身的大分子和小分子的組成進行調整，同時也會產生特定的物質如酶等來適應新的環境。對數生長期是微生物對新的環境適應之后，菌體生長繁殖速度呈幾何級數的階段，是菌體數量增長最快的一個階段，表現為菌體數量增加，菌體重量增加。但是到了對數期的末期，由于細菌的生長營養物質消耗以及細菌正常生理代謝產物的積累，細菌的生長繁殖速率下降。穩定期是細菌生長速率與死亡速率趨于平衡的階段。衰亡期細菌數明顯下降。格氏乳酸桿菌的生長曲線如圖1所示，從圖1可見，格氏乳酸桿菌的濃度從104個數量級經過14h的培養迅速上升到1010個數量級，到48h，細菌的數量級沒有變化，只是活菌數有下降的趨勢，主要原因是培養基營養物質濃度下降，培養基中有害代謝產物增加引起菌體死亡，生長繁殖的菌體數量比死亡的菌體數量更多，導致總的活菌數量減少。益生菌產品的活菌數普遍偏低，在美國有一項調查表明81%的益生素產品活菌數比標簽上聲明的數量要低得多（Fuller，1999），可能的原因之一是一些廠家為了降低生產成本，在制造時就沒有按要求達到所規定的活菌數。從生長曲線可以看出，格氏乳酸桿菌的最佳收獲期在培養后14～24h。在這一段時間收獲菌體，可以減少獲得單位活菌的成本。
2.2 耐酸存活率
成年豬的胃pH值一般為1～2，斷奶仔豬胃的pH值變異較大，一般為2.60～5.83（楊 琳等，2001），胃環境對細菌的破壞是pH依賴的酸水解作用，pH小于2.5時殺菌作用很明顯，胃是動物消除進入體內病原微生物的第一道屏障， 當然正是這種胃的酸性環境對進入體內的有益微生物的活力會產生不利的影響。本試驗在體外模擬仔豬胃內的酸度， 考慮到斷奶仔豬胃內還有其它的抑菌因素， 采用比正常斷奶仔豬胃內更低的酸度pH2.0的培養液測定不同處理時間格氏乳酸桿菌的活菌濃度，不同處理時間的活菌濃度見表2。
從表2可見，在pH2.0處理的前4h，格氏乳酸桿菌還有一定的生長，說明格氏乳酸桿菌的耐酸性能較好，但到了第6h活菌數開始下降，但也比起始活菌數高，只是到了第8h，活菌數才呈急劇的下降，與細菌的大量死亡有關。格氏乳酸桿菌是一株分離自斷奶仔豬胃粘膜上皮細胞的乳酸桿菌，在仔豬飼料中添加的預期目標也是使其能夠被仔豬攝食后在胃內定植、生長和繁殖，從而發揮抑制病原菌的益生作用。仔豬胃部的pH值范圍一般為2.60～5.83，這說明格氏乳酸桿菌對胃的低pH環境完全可以耐受而且數量還可以有一定的增加。尤其是當胃部的pH值因斷奶而上升時，格氏乳酸桿菌的生長速率勢必加快，胃內格氏乳酸桿菌增加有利于保持胃內微生物菌群的平衡，形成正常的微生物菌群對抑制病原菌的繁殖和在胃粘膜的粘附具有重要作用，同時乳酸桿菌分泌的乳酸對降低胃內pH也有一定的補充作用，這對提高仔豬胃抑制病原菌的能力、提高胃蛋白酶原的活化和胃蛋白酶的活力將有很大益處。
2.3 耐熱存活率
格氏乳酸桿菌經過75℃處理15min后的活菌濃度如下：
處理前：5.7×109CFU/ml，75℃處理后4.1×109 CFU/ml，存活率為72%。一般仔豬飼料的調質和制粒溫度為70～85℃之間，飼料在調質腔和制粒機內總的時間為25～30s，格氏乳酸桿菌經過75℃之后存活率能達到72%，說明這一株乳酸桿菌在飼料制粒時可以耐受制粒時的高溫，作為飼料添加劑將會有很好的前途。這個存活率也比前人報道的高很多倍，許多報道乳酸桿菌經過70℃以上的高溫處理之后，存活率幾乎為零。而且耐高溫之后存活率低也是乳酸桿菌作為飼料添加劑的主要限制性因素之一。從本試驗的結果看格氏乳酸桿菌的耐熱性能是良好的。
2.4 貯藏存活率
格氏乳酸桿菌的起始活菌濃度為每毫升4.5×1010CFU，經過一月之后活菌濃度為每毫升1.7×1010CFU，貯藏存活率為37.8%。從本試驗的結果看，含有該菌株的益生素產品在體外的貯藏時間不宜太長，最好在一個月之內使用完。一般的預混料的保質期是3～4個月，使用格氏乳酸桿菌的益生素產品應標明適當的保質期，以保證仔豬在采食時能攝入足夠數量的活菌。
2.5 發酵參數的優化
本試驗考慮的影響格氏乳酸桿菌生長繁殖較大的因素主要有時間、碳源如葡萄糖和蔗糖、氮源有胰蛋白胨和檸檬酸銨以及生長促進物質酵母浸粉，優化的組分主要以MRS培養基的組成成分為基準。試驗結果見表3，從表3可見，用均勻設計法安排的6種不同發酵方案對格氏乳酸桿菌的活菌濃度有明顯的影響。試驗結果采用均勻設計軟件4.0版中的二次回歸和逐步回歸的方法對各因素的解進行最優化，同時對不同影響因素之間的相關系數也進行了考察，不同影響因素的相關系數見表4，優化結果見表5。從表4可以看出，時間、葡萄糖和胰蛋白胨對格氏乳酸桿菌的生長具有正面效應，而檸檬酸銨、酵母浸粉和蔗糖則呈現負效應，尤其是檸檬酸銨，在濃度高時對提高格氏乳酸桿菌的生長量是不利的。葡萄糖和蔗糖、胰蛋白胨有一定的協同作用，而和酵母浸粉、檸檬酸銨有拮抗作用，葡萄糖濃度高時，延長發酵時間對菌體濃度是不利的。從表5可以看出格氏乳酸桿菌的發酵參數的優化組成，為今后的發酵生產提供了一套重要的數據。
3 小結
格氏乳酸桿菌在發酵后14～24h是合適的菌體收獲期；格氏乳酸桿菌的耐熱存活率為72%，耐貯藏存活率為37.8%，耐酸存活率為133%；不同氮源對格氏乳酸桿菌的發酵活菌濃度影響較大，胰蛋白胨對其活菌濃度有正效應，而銨鹽對其生長有負效應。優化后的發酵參數為：時間，20h；葡萄糖，110g/l；蔗糖，60g/l；胰蛋白胨，30g/l；酵母浸粉，30g/l；檸檬酸銨，2g/l。
參考文獻
