摘 要 仔豬大腸桿菌性腹瀉病的致病機(jī)理主要與產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（ETEC）菌毛介導(dǎo)的粘附作用和腸毒素的產(chǎn)生與釋放密切相關(guān)。通過特異性免疫生產(chǎn)的雞卵黃抗體，是預(yù)防仔豬大腸桿菌性腹瀉病的一種新的方法；而且能有效降低仔豬的腹瀉發(fā)生率，并提高仔豬的增重。文中綜述了國(guó)內(nèi)外用雞卵黃抗體防治仔豬大腸桿菌腹瀉的研究進(jìn)展，討論了現(xiàn)階段雞卵黃抗體存在的不足，并提出基因工程技術(shù)在卵黃抗體研制開發(fā)中的應(yīng)用前景。

仔豬腹瀉是困擾規(guī)模化養(yǎng)豬生產(chǎn)的主要難題之一，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。致病性大腸桿菌是造成新生仔豬和斷奶仔豬腹瀉的最重要的病原，其中產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（Enterotoxigenic
Escherichia coil，ETEC）是最主要的致病菌（Morris等，1985；楊正時(shí)，1987；Yokayama等，1992；Alexander,1994；Hampson，1994）。Bergland（1980）報(bào)道，從斷乳前腹瀉仔豬中分離到ETEC的機(jī)率為45.6%，其頻度比豬球蟲(23%)和輪狀病毒(20.9%)感染的總和還多。Alexander（1994）發(fā)現(xiàn)，由ETEC引起仔豬斷奶前腹瀉而造成的死亡率占仔豬死亡率的11％。同年，Hampson等另一項(xiàng)調(diào)查認(rèn)為ETEC造成的仔豬斷奶后腹瀉平均每年就造成1.5%～2%的斷奶仔豬死亡。王紅寧等（1999）在1995～1999年間對(duì)四川等地規(guī)模化豬場(chǎng)的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，由ETEC引起的仔豬黃、白痢的發(fā)生率達(dá)20％～60％，混合感染死亡率可達(dá)60％以上。

抗生素作為控制細(xì)菌感染的有效藥物廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)中，但抗生素的長(zhǎng)期使用引起的耐藥性問題和生產(chǎn)中超量使用抗生素的現(xiàn)象越來越突出，但控制效果卻并不樂觀。抗生素替代品的研究成為畜牧業(yè)發(fā)展的迫切需求。

初生仔豬和早期斷奶仔豬自身免疫功能的不成熟以及早期斷奶應(yīng)激引起的免疫抑制，是造成仔豬對(duì)ETEC敏感性增高、抗病力下降，并引發(fā)ETEC感染性腹瀉的主要因素。利用外源抗體為仔豬提供被動(dòng)免疫從而預(yù)防和治療腸道ETEC感染引起的疾病的研究將近已有一個(gè)世紀(jì)的歷史，并證明了外源性抗體的有效作用。其中，雞卵黃抗體因其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、特異性抗體含量高、安全性好、易規(guī)模化生產(chǎn)等特點(diǎn)，而越來越受到人們的注意，并有潛力開發(fā)為一類可替代抗生素的高效生物防治制劑。近年來國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果也證明，應(yīng)用卵黃抗體防治由ETEC引起的仔豬腹瀉，能夠取得比較滿意的效果。

根據(jù)抗原的制備方式，預(yù)防仔豬大腸桿菌性腹瀉卵黃抗體的生產(chǎn)方式可以分為兩類：一類是直接用ETEC的菌體蛋白作為免疫原，而另一類則是將經(jīng)分離純化后的菌毛蛋白作為免疫原。有研究證明，后者免疫獲得的卵黃抗體的應(yīng)用效果優(yōu)于前者（Kim等，1996；肖馳等，1998；Marquardt等，1999）。然而，由分離純化后的菌毛抗原制備的卵黃抗體，其成本較高。通過基因工程技術(shù)，構(gòu)建高量表達(dá)菌毛蛋白的大腸桿菌，為解決這一問題提供了有效的手段。本文擬對(duì)預(yù)防仔豬大腸桿菌性腹瀉卵黃抗體的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 卵黃抗體的特性及作用機(jī)理

自Klemperer于1893年首次報(bào)道雞蛋中存在抗體以來，人們對(duì)蛋中抗體的研究不斷深入。蛋內(nèi)的抗體主要存在于蛋黃內(nèi)，以IgG占優(yōu)勢(shì)，IgA和IgM的含量極低（Roth，1981；Locken，1983）。利用經(jīng)過特異性免疫的母雞來生產(chǎn)卵黃抗體，比從哺乳動(dòng)物血液中獲得的抗體具有突出的優(yōu)越性：①易于生產(chǎn)。實(shí)際生產(chǎn)中，動(dòng)物采血不僅對(duì)動(dòng)物本身是極大的應(yīng)激，且費(fèi)時(shí)費(fèi)工。雞產(chǎn)蛋無傷害性和對(duì)佐劑不起像哺乳動(dòng)物中出現(xiàn)的嚴(yán)重反應(yīng)，因而方便得多；②產(chǎn)量高，成本低
。以一只母雞為例，其年產(chǎn)蛋量為200～300枚，每只蛋中約含抗體100～150mg（Larsson，1993）；③卵黃抗體穩(wěn)定性好，耐酸、耐堿、耐熱（Losch等，1986；Shimizu等，1992；李學(xué)伍，2000），有利于運(yùn)輸、貯藏。

預(yù)防仔豬大腸桿菌性腹瀉卵黃抗體對(duì)宿主特異性菌毛抗原有強(qiáng)烈的親和力（Yutaka，1995），能夠阻斷或降低宿主特異性菌毛與仔豬小腸上皮的結(jié)合，使ETEC不能在小腸定居繁殖，從而阻斷了大腸桿菌產(chǎn)生腸毒素，防止和減少仔豬腹瀉的發(fā)生（Jin等，1998）。

2 預(yù)防仔豬大腸桿菌性腹瀉卵黃抗體對(duì)仔豬腹瀉的效果

盡管預(yù)防仔豬大腸桿菌性腹瀉卵黃抗體的生產(chǎn)方式不同，其機(jī)理都是通過特異性的卵黃抗體來阻斷或降低大腸桿菌的宿主特異性菌毛與仔豬小腸上皮的結(jié)合（Jin等，1998），使ETEC不能在小腸定居繁殖和產(chǎn)生腸毒素，從而防止腹瀉的發(fā)生。飼料中添加少量的卵黃抗體，可以顯著地降低仔豬腹瀉率，并在一定程度上提高動(dòng)物的增重、飼料轉(zhuǎn)化率。

一些研究者直接用大腸桿菌菌株免疫產(chǎn)蛋母雞來獲得卵黃抗體（胡子信，1994；李國(guó)平，2002）。李國(guó)平等（2002）用ETEC K88、K99、987P、F41標(biāo)準(zhǔn)菌株制成的滅活油佐劑作為免疫原，待產(chǎn)蛋雞免疫后收集高免卵黃，然后提取、純化，精制成雞抗豬大腸桿菌特異性高免卵黃抗體并用于臨床。結(jié)果表明該制劑安全性好，每頭仔豬注射或口服2～4ml劑量，能有效預(yù)防仔豬大腸桿菌性腹瀉。而徐福洲等（2002）同樣利用ETEC標(biāo)準(zhǔn)菌株制備滅活苗,免疫待開產(chǎn)母雞，提純卵黃抗體對(duì)攻毒仔豬口服治療，結(jié)果顯示治療仔豬腹瀉狀況明顯減輕，與對(duì)照組相比有顯著差異；治療組未出現(xiàn)死亡而對(duì)照組仔豬有33%～67%的死亡率。此結(jié)果表明，卵黃抗體治療由ETEC所致的仔豬腹瀉具有明顯的效果。

另外一些研究者則采用分離出純化后的大腸桿菌菌毛蛋白作為免疫原，通過多次免疫健康的產(chǎn)蛋母雞，從而獲得卵黃抗體。Yokoyama（1992）將提純的ETEC宿主特異性菌K88、K99、987P制成菌毛蛋白疫苗，胸部肌肉注射免疫產(chǎn)蛋母雞，抗體達(dá)到高效價(jià)后，收集雞蛋從蛋黃中分離和噴霧干燥抗體，對(duì)不同ETEC菌株感染的初生未食初乳仔豬用適當(dāng)?shù)目贵w治療。試驗(yàn)中，所有仔豬接受不同菌株感染后12h內(nèi)均發(fā)生中度或嚴(yán)重腹瀉，用效價(jià)為1：625和1：2
500的抗體治療仔豬全部存活，而對(duì)照組超過80%的仔豬死亡。同時(shí)，他們還研究了從雞蛋卵黃中提取干粉抗體的方法。所提純的卵黃抗體可以用于治療仔豬大腸桿菌腹瀉；使用前的保存和運(yùn)輸過程不需低溫，使用方便而且效果比較可靠。Yutaka（1992）在飼糧中添加經(jīng)ETEC
K99菌毛蛋白免疫得到的卵黃抗體，當(dāng)效價(jià)為1：800和1：1 600時(shí)，能夠有效治愈所有腹瀉仔豬，并提高了仔豬的日增重。

本實(shí)驗(yàn)室用分離提純的特異性菌毛抗原制備抗ETEC 的卵黃抗體，應(yīng)用細(xì)菌體外粘附試驗(yàn)研究了卵黃抗體預(yù)防仔豬ETEC感染性腹瀉的機(jī)制，并通過飼養(yǎng)試驗(yàn)研究了卵黃抗體預(yù)防斷奶仔豬腹瀉的效果。結(jié)果表明：在體外試驗(yàn)中，無抗體的對(duì)照組平均每個(gè)上皮細(xì)胞黏附16.4個(gè)K88ac；抗體效價(jià)分別為1：640和1：1
280的卵黃抗體較對(duì)照組均極顯著抑制了K88ac對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附作用（P<0.01），平均每個(gè)上皮細(xì)胞分別僅黏附8.5和2.4個(gè)細(xì)菌，二者之間也存在極顯著差異（P<0.01）；抗體效價(jià)為1：320的抗體組相對(duì)對(duì)照組有一定抑制細(xì)菌粘附作用，但差異不顯著（P＝0.15）。用90頭28日齡斷奶仔豬進(jìn)行了為期4周的飼養(yǎng)試驗(yàn)。試驗(yàn)以玉米—豆粕典型日糧為對(duì)照組，在對(duì)照組日糧中分別添加0.5％、1％、2％的噴霧干燥卵黃粉形成試驗(yàn)一組、試驗(yàn)二組和三組的試驗(yàn)日糧。添加1％卵黃抗體粉顯著降低了料肉比和腹瀉率（P<0.05），促進(jìn)了試驗(yàn)期仔豬的平均日增重（P=0.052）。

Kim等(1996)曾分別以ETEC的K88菌毛和減毒菌株作為抗原制備卵黃抗體，并對(duì)其效價(jià)進(jìn)行了比較，結(jié)果表明前者免疫得到的卵黃抗體效價(jià)明顯高于后者。為比較由菌毛免疫和菌株免疫兩種不同方法所得卵黃抗體的臨床效果，肖馳等（1998）用這兩種方法制備的卵黃抗體進(jìn)行了臨床預(yù)防和治療試驗(yàn)；結(jié)果表明，兩種卵黃抗體均能有效地預(yù)防和治療仔豬大腸桿菌性腹瀉；但菌毛蛋白疫苗卵黃抗體的應(yīng)用效果更好。

此外，部分研究者用多價(jià)菌苗免疫獲得卵黃抗體，用于防治仔豬腹瀉也取得較好的效果，同時(shí)增加了卵黃抗體作用的廣譜性。胡子信等（1994）將引起仔豬嚴(yán)重發(fā)病的腸產(chǎn)毒素性大腸桿菌K88、K99、987P三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株，制成大腸桿菌三價(jià)菌苗，免疫接種健康產(chǎn)蛋雞，制成雞抗豬大腸桿菌高免卵黃液，并用以對(duì)仔豬大腸桿菌病進(jìn)行預(yù)防和治療，其有效率達(dá)到100%。李學(xué)伍（2000）等用分離純化后的多價(jià)菌株的菌毛蛋白作為抗原，制備了抗仔豬大腸桿菌性腹瀉的多價(jià)卵黃抗體。經(jīng)試驗(yàn)證明，該多價(jià)卵黃抗體粉對(duì)發(fā)病仔豬的治愈率最高可達(dá)97.7%，比藥物治療的治愈率高21.2%。然而，華榮虹等（2002）比較K88、K99、987P、F41單一菌毛免疫與4種菌毛混合免疫母雞的效果發(fā)現(xiàn)，菌毛單獨(dú)免疫后卵黃抗體效價(jià)均高于混合菌毛苗免疫后相應(yīng)卵黃抗體的效價(jià)。

在選擇試驗(yàn)菌株時(shí)，大部分人選用標(biāo)準(zhǔn)菌株，也有一些研究者選用地方株。如Marquardt等（1999）采用地方株ETEC（K88+）菌毛抗原免疫母雞后獲得卵黃抗體，其對(duì)新生和斷奶感染ETEC的仔豬不僅有保護(hù)作用，而且在商業(yè)性豬場(chǎng)用于提前斷奶的仔豬也有效。他們的試驗(yàn)結(jié)果表明，用K88+
E.coli誘導(dǎo)而腹瀉的3日齡仔豬，在用雞蛋抗體后24h被治愈。而用未免疫母雞蛋黃粉處理的，仔豬繼續(xù)腹瀉，其中62.5%因嚴(yán)重腹瀉而死亡。在21日齡斷奶仔豬的感染試驗(yàn)中，飼喂蛋黃抗體后有短暫的腹瀉，試驗(yàn)期間100%存活且體重明顯增加，而對(duì)照組則出現(xiàn)嚴(yán)重的腹瀉和脫水癥狀，且48h內(nèi)有仔豬死亡。對(duì)豬場(chǎng)14～18日齡的斷奶仔豬的飼喂試驗(yàn)表明：飼喂含卵黃抗體日糧的仔豬在腹瀉發(fā)生率和嚴(yán)重程度上均比飼喂含抗菌素的商品日糧組低。高云英等（2003）應(yīng)用仔豬大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和地方分離菌株混合免疫商品蛋雞，收獲高免蛋制備多價(jià)卵黃抗體。經(jīng)預(yù)防、攻毒試驗(yàn)及臨床治療效果觀察,對(duì)仔豬免疫保護(hù)率可達(dá)90%以上，攻毒保護(hù)率98%以上，臨床治愈率95%以上。

3 利用基因工程技術(shù)制備菌毛抗原的研究

過去的研究中，ETEC 菌毛蛋白提取純化方法已得到不斷優(yōu)化，而卵黃抗體的生產(chǎn)加工也已逐步工業(yè)化。本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中也已經(jīng)建立了快速準(zhǔn)確的ETEC及其亞型的分子鑒定方法，并研制開發(fā)出預(yù)防仔豬大腸桿菌性腹瀉卵黃抗體。然而，針對(duì)菌毛蛋白表達(dá)量少的問題，有必要進(jìn)一步研究降低抗原生產(chǎn)成本的技術(shù)。

基因工程的本質(zhì)就是按照人們的設(shè)計(jì)藍(lán)圖，將生物體內(nèi)控制性狀的基因進(jìn)行優(yōu)化重組，并使其穩(wěn)定遺傳和表達(dá)。基因工程技術(shù)利用細(xì)菌（如大腸桿菌和酵母菌等）基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制相對(duì)簡(jiǎn)單和生長(zhǎng)速度較快等特點(diǎn)，令其超量合成其它生物體內(nèi)含量極微但卻具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的生化物質(zhì)。目前，已有100多種異源蛋白通過大腸桿菌基因工程均實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，其中包括一些結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜的人體蛋白，如富含半胱氨酸殘基的血清白蛋白（HAS）、尿激酶原（pro-UK）、金屬硫蛋白等（張惠展，2002）。

國(guó)內(nèi)外已有許多研究者在構(gòu)建ETEC粘附素抗原的基因工程菌株方面開展了工作。Mooi FR等（1981）構(gòu)建了含有K88ab抗原基因的重組質(zhì)粒pFM205，進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得的重組菌株能與特異性抗K88ab的抗體結(jié)合。Dougan
等（1983）構(gòu)建了含K88ac粘附素抗原的質(zhì)粒pMF005，重組質(zhì)粒依賴pBR322自身編碼的啟動(dòng)子，能使K88ac粘附素抗原的表達(dá)水平升高。此外，這些研究者認(rèn)為，若
pBR322啟動(dòng)子被編碼色氨酸的啟動(dòng)子取而代之，那么當(dāng)色氨酸啟動(dòng)子被阻遏時(shí)，重組質(zhì)粒Trp-pMK005表達(dá) K88ac粘附素抗原的水平提高（Kehoe
M等，1983）。后來，Dougan 等（1986）用免疫試驗(yàn)證明了含重組質(zhì)粒pMK005的工程菌株具有較好的免疫活性，但對(duì)于如何解決K88粘附素抗原的高效表達(dá)沒有進(jìn)一步的研究。Holoda
E和Mikula I（1994）曾報(bào)道用Ptac 啟動(dòng)子代替質(zhì)粒pBR322的P啟動(dòng)子，使K88ab抗原更易在受體菌中表達(dá)；且表達(dá)量高于K88ab野生型菌株，其中在受體菌E.coli
C600中表達(dá)量最高，同時(shí)在沙門氏傷寒菌TM333中的表達(dá)水平與E.coli C600相當(dāng)（Holoda E和Mikula I，1995）。但對(duì)于構(gòu)建后工程菌株粘附素蛋白表達(dá)的穩(wěn)定性并未進(jìn)行研究。

在國(guó)內(nèi)，洪孟民等（1985）率先研制成ETEC K88工程菌；而張林元等（1985）用不同的受體菌也構(gòu)建了不產(chǎn)生腸毒素的K88ac抗原工程菌株。同時(shí)，張景六等（1985）構(gòu)建了帶有K88和K99兩種菌毛抗原基因的質(zhì)粒，為預(yù)防不同菌毛抗原型ETEC引起的仔豬腹瀉提供了更廣泛的作用。而攜帶此質(zhì)粒的工程菌株合成K99亞基和菌毛的能力略差于僅表達(dá)K99菌毛抗原的菌株。隨后，李豐生等（1987）用基因工程技術(shù)構(gòu)建了含ETEC
K88ac和LT（A-B+）兩種抗原基因的菌株。此菌株的菌毛抗原的表達(dá)量與其親本株基本相同。20世紀(jì)90年代，吳雅旭等（1991）用強(qiáng)啟動(dòng)子代替載體自身的啟動(dòng)子，結(jié)果獲得了菌毛抗原表達(dá)效率為原株16倍的ETEC
K88ac抗原基因工程株。然而，研究者發(fā)現(xiàn)該重組子原代細(xì)胞于4℃放置數(shù)天，或連續(xù)傳幾代后，即使在氨卞青霉素抗性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，表達(dá)水平也會(huì)明顯降低。可見，其質(zhì)粒不穩(wěn)定，易丟失。針對(duì)這一缺陷的改進(jìn)，將近十年國(guó)內(nèi)都沒有相關(guān)的研究報(bào)道。

可以預(yù)見，隨著基因工程技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，以及新啟動(dòng)子的不斷出現(xiàn)和DNA重組載體/受體系統(tǒng)的多樣化，可以利用基因工程技術(shù)來構(gòu)建高效、穩(wěn)定表達(dá)ETEC菌毛蛋白的菌株，提高菌毛抗原的產(chǎn)量，從而大大降低卵黃抗體成本，促進(jìn)這一替代抗生素新型添加劑的廣泛應(yīng)用。