不同蛋白質(zhì)和能量水平日糧條件下30～150日齡羔羊采食、消化、體增重和瘤胃消化代謝的變化，并認(rèn)為100日齡是羔羊消化發(fā)育的一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)（朱文濤等，2004），作者則報(bào)道在如上條件下羔羊瘤胃原蟲(chóng)和細(xì)菌的數(shù)量變化。?

　　1　材料與方法

　　1.1　試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理　

　　將16只30日齡體重約6～10 kg羅姆尼與新疆美利奴羊雜交公羔, 裝置永久性瘤胃瘺管，瘺管直徑為2.5 cm。術(shù)后護(hù)理5～7 d后隨機(jī)分為4組（1、2、3和4組），每組4只，分別喂以4種不同的日糧(表1)。所用動(dòng)物在一出生后即訓(xùn)練采食。在試驗(yàn)期間動(dòng)物單圈飼養(yǎng)，將日糧充分混合后每天在8：00和19：00分2次平均定量喂給，自由采食，自由飲水。

　　４種日糧的組成及營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1, 主要參照NRC標(biāo)準(zhǔn)（1975）和Hoover等（1991）配制。第1組動(dòng)物喂以高能高蛋白質(zhì)水平日糧（日糧1），第2組動(dòng)物喂以高能一般蛋白質(zhì)水平日糧（日糧2），第3組動(dòng)物喂以一般能量但高蛋白質(zhì)水平日糧（日糧3），第4組動(dòng)物喂以一般能量和蛋白質(zhì)水平日糧（日糧4）。表1中所列日糧的有機(jī)物、粗蛋白質(zhì)、纖維素、半纖維素、鈣和磷的含量均為實(shí)測(cè)值，可消化能（以下簡(jiǎn)稱能量）系根據(jù)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧所中國(guó)飼料成分及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值表中的綿羊數(shù)據(jù)估算而得。?

　　1.2　瘤胃液樣品的采集與處理　

　　以每15 d為一研究時(shí)間段，在每個(gè)時(shí)間段的第9、10和11 d，連續(xù)3 d，在每天第1次喂料后的第0、1、3、6和9 h采取瘤胃液樣品，測(cè)定pH后用雙層紗布過(guò)濾，取20 ml過(guò)濾液加2滴飽和氯化汞，混勻后密閉于-20℃保存?zhèn)溆谩?

　　1.3　瘤胃液微生物的計(jì)數(shù)

　　1.3.1　瘤胃液原蟲(chóng)的計(jì)數(shù)　

　　在計(jì)數(shù)前預(yù)先配制?1號(hào)?固定液（4%福爾馬林40 ml，NaCl 9.0 g，蒸餾水960 ml）、2號(hào)固定液（冰醋酸0.3 ml，蒸餾水?99.7 ml?）和M.F.S溶液（35%福爾馬林100 ml，NaCl8.0 g，甲基綠0.6 g，蒸餾水900 ml）。?

　　將瘤胃液樣品搖勻，用2層醫(yī)用紗布過(guò)濾去掉大塊食物和雜質(zhì)。取1號(hào)、2號(hào)固定液按1∶2比

例混勻，取混合液和瘤胃液樣品等量(0.1 ml)并混勻，然后用M.F.S溶液倍比稀釋。為便于

鏡檢通常將瘤胃液稀釋至20～50倍（稀釋倍數(shù)以每方格內(nèi)平均有?5個(gè)?左右蟲(chóng)體為宜）。

用10×40倍顯微鏡計(jì)數(shù)。?

　　測(cè)數(shù)用血球計(jì)數(shù)板，但因通常的計(jì)數(shù)室深為?0.1 mm?，大型蟲(chóng)體不能進(jìn)入室內(nèi)，從而減少了對(duì)原蟲(chóng)的計(jì)數(shù)，所以在鏡檢前將其改裝成0.5 mm深（盧德勛等，1999）。1個(gè)血球計(jì)數(shù)板有2個(gè)計(jì)數(shù)室，每個(gè)計(jì)數(shù)室有8個(gè)大方格，每個(gè)大方格內(nèi)有16個(gè)小格。?1個(gè)?大方格面積為1mm?2。?

　　用管孔口徑大于1.0 mm的吸管將搖勻的樣品稀釋液以連續(xù)不斷的流液充滿計(jì)數(shù)室，靜置2 min后鏡檢。對(duì)四邊壓線的蟲(chóng)體按計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右的原則來(lái)處理。同一樣品計(jì)數(shù)4次，取其平均值。按下列公式計(jì)算每毫升瘤胃液中原蟲(chóng)數(shù)量：原蟲(chóng)數(shù)/ml=X/S×D×2×1000?其中：　X為所有方格中的原蟲(chóng)總數(shù)，S為計(jì)數(shù)方格數(shù)，D為稀釋倍數(shù)。?

　　因計(jì)數(shù)室每個(gè)大方格面積為1 mm?2，乘以?0.5 mm?（計(jì)數(shù)室深度）等于0.5 mm?3，換算

成1 cm?3?（1 ml）?則需乘以2×1000。?

　　1.3.2　瘤胃液細(xì)菌的計(jì)數(shù)　

　　將瘤胃液樣品搖勻，用2層醫(yī)用紗布過(guò)濾去掉大塊食物和雜質(zhì)后，取瘤胃液樣品(0.1 ml)和95%酒精按1∶2比例混勻，然后用結(jié)晶紫溶液倍比稀釋。為便于鏡檢，稀釋度一般控制在每小格菌數(shù)30～150個(gè)。?

　　用吸管將搖勻的樣品稀釋液以連續(xù)不斷的流液充滿計(jì)數(shù)室，靜置3～4 min用10×100倍油鏡觀察，并且顯微鏡需安裝測(cè)微尺以觀察細(xì)菌大小。對(duì)四邊壓線的細(xì)菌按計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右的原則來(lái)處理。同一樣品計(jì)數(shù)4次，取其平均值。按下列公式計(jì)算每毫升瘤胃液中細(xì)菌數(shù)量：?

　　細(xì)菌數(shù)/ml=X/S×D×16×10×1000?

　　其中：X為所有方格中的細(xì)菌總數(shù)，S為計(jì)數(shù)方格數(shù)，D為稀釋倍數(shù)。?

　　因計(jì)數(shù)選擇計(jì)數(shù)板凹槽為0.1 mm，所選方格面積為0.0625 mm?2，換算成1 cm?3則需乘以16×10×1000。?

　　細(xì)菌的分類：瘤胃液細(xì)菌計(jì)數(shù)分類參照斯塔尼爾等（1983）和陸承平（2001）的方法，即將細(xì)菌分為大桿菌、小桿菌、球菌、鏈球菌和新月芽菌分別計(jì)數(shù)。?

　　將3 d中每天5個(gè)時(shí)間點(diǎn)共計(jì)15個(gè)瘤胃液樣品計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值，作為該研究時(shí)間段飼喂不同日糧的各動(dòng)物個(gè)體的數(shù)據(jù)。?

　　1.3　統(tǒng)計(jì)分析　

　　數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS11.0版統(tǒng)計(jì)軟件中Analyze菜單下Compare Means模型中One?Way A　NOVA模塊進(jìn)行。

　　2　結(jié)果
　　
　　2.1　4種日糧條件下30～150日齡期間羔羊瘤胃液原蟲(chóng)數(shù)量的變化
　
　　如表2所見(jiàn)，羔羊瘤胃液原蟲(chóng)數(shù)量明顯地隨日齡而不斷增加，并且到120日齡時(shí)原蟲(chóng)的數(shù)量即已基本穩(wěn)定，約為試驗(yàn)初期的4～8倍。在75～90日齡段，羔羊瘤胃中的原蟲(chóng)數(shù)量增加迅速，而對(duì)于高能量日糧（日糧1和2）而言，在105～120日齡，還有第2個(gè)原蟲(chóng)數(shù)量迅速增加的時(shí)段。在105日齡之后，日糧的能量水平明顯影響瘤胃原蟲(chóng)的數(shù)量，就120 ～135日齡羔羊而言，在高能量日糧瘤胃液原蟲(chóng)數(shù)量要比一般能量日糧的多27%（日糧1比日糧3）（P<0.05）和18%（日糧2比日糧4）（P<0.05），而日糧蛋白質(zhì)水平對(duì)瘤胃液原蟲(chóng)數(shù)量的影響則不明顯。?

　　2.2　4種日糧條件下30～150日齡期間羔羊瘤胃液細(xì)菌數(shù)的變化

　　羔羊瘤胃液細(xì)菌總數(shù)隨日齡而不斷增加（表2），基本上持續(xù)到120～135日齡以后，從30～150日齡羔羊瘤胃液的數(shù)量增加了0.5～3倍。日糧能量和蛋白質(zhì)水平對(duì)瘤胃液細(xì)菌總數(shù)的影響

在本試驗(yàn)不明顯。?

　　羔羊瘤胃液中大桿菌的數(shù)量隨日齡而不斷增加，而且一直持續(xù)到試驗(yàn)?zāi)┢诩?35～150日齡，比試驗(yàn)初期增加了2～5倍。由表2可見(jiàn)，日糧的蛋白質(zhì)水平影響瘤胃液大桿菌數(shù)量，而日糧的能量水平對(duì)大桿菌的數(shù)量則無(wú)顯著影響。?

　　羔羊瘤胃液小桿菌的數(shù)量也是隨動(dòng)物的日齡而不斷增加，到135日齡之后則相對(duì)穩(wěn)定下來(lái)，比試驗(yàn)初期增加了0.5～3倍。日糧能量和蛋白質(zhì)水平對(duì)瘤胃液小桿菌數(shù)量的影響在本試驗(yàn)不明顯。

　　羔羊瘤胃液中的球菌、鏈球菌的數(shù)量也均隨著動(dòng)物的日齡而不斷增加，但在105日齡就已基本穩(wěn)定。并且日糧的能量和蛋白質(zhì)水平對(duì)瘤胃液球菌、鏈球菌數(shù)量的影響在本試驗(yàn)亦不明顯。?

　　瘤胃液新月芽菌在試驗(yàn)初期隨動(dòng)物日齡而增加，但在75日齡后其數(shù)量的變化與動(dòng)物的日齡、日糧中能量和蛋白質(zhì)的含量，均無(wú)顯著的相關(guān)關(guān)系。?

　　3　討論　

　　3.1　羔羊日齡與瘤胃液原蟲(chóng)、細(xì)菌數(shù)量的關(guān)系　

　　瘤胃微生物包括原蟲(chóng)（即纖毛蟲(chóng)）、細(xì)菌、真菌和噬菌體4類。本試驗(yàn)結(jié)果清楚地表明，羔羊瘤胃液原蟲(chóng)和細(xì)菌數(shù)量是隨著動(dòng)物的日齡而增加的，提示了瘤胃微生物消化是一個(gè)不斷發(fā)育的過(guò)程，但同時(shí)也表明各種微生物數(shù)量變化的差異性，從總體看，原蟲(chóng)和細(xì)菌總數(shù)在120日齡即已基本穩(wěn)定，但在整個(gè)試驗(yàn)期原蟲(chóng)的增量比細(xì)菌要大，而且不同形態(tài)的細(xì)菌的增速和到達(dá)基本穩(wěn)定的日齡也不相同。如果考慮到在試驗(yàn)期瘤胃液體積也增加了15倍，瘤胃細(xì)菌數(shù)則增加了30倍以上，而原蟲(chóng)數(shù)增加了60倍以上。?

　　在試驗(yàn)初期的30～45日齡，羔羊瘤胃液中即有一定數(shù)量的原蟲(chóng)和相當(dāng)數(shù)量的細(xì)菌，表明在這

之前瘤胃的微生物消化功能就已開(kāi)始形成。?

　　3.2　羔羊日糧能量、蛋白質(zhì)水平與瘤胃液原蟲(chóng)、細(xì)菌數(shù)量的關(guān)系
　
　　顯而易見(jiàn)，日糧的能量水平影響瘤胃液中原蟲(chóng)的數(shù)量，日糧中可消化能量高，原蟲(chóng)數(shù)量就多，而蛋白質(zhì)水平的影響就不明顯。除了瘤胃大桿菌數(shù)量受日糧的蛋白質(zhì)水平影響之外，日糧的能量、蛋白質(zhì)水平對(duì)瘤胃液細(xì)菌總數(shù)或其它各種細(xì)菌數(shù)量的影響不顯著。因此可以初步認(rèn)為羔羊日糧與瘤胃微生物的關(guān)系主要表現(xiàn)在日糧中可消化能量與原蟲(chóng)的數(shù)量關(guān)系上。

?
　　3.3　羔羊瘤胃液原蟲(chóng)、細(xì)菌數(shù)量與消化代謝的關(guān)系　

　　將羔羊?qū)θ占Z中纖維素、半纖維素消化率隨日齡的變化（朱文濤等，2004）與瘤胃原蟲(chóng)、細(xì)

菌總數(shù)和各種細(xì)菌數(shù)（除新月芽菌外）隨日齡的變化相比照，可以認(rèn)為瘤胃微生物數(shù)量的增加提高了動(dòng)物對(duì)日糧中纖維素、半纖維素的消化能力。羔羊在60日齡后飼料轉(zhuǎn)化率開(kāi)始降低（朱文濤等，2004），從本試驗(yàn)結(jié)果看，是與微生物的數(shù)量，特別是原蟲(chóng)數(shù)量的增加有關(guān)。因此，研究怎樣延緩瘤胃液中微生物數(shù)量的增加，特別是限制原蟲(chóng)數(shù)量的增加，可能是提高或保持羔羊較高飼料轉(zhuǎn)化率的一個(gè)新途徑。?

　　4　結(jié)論　

　　30～150日齡羔羊瘤胃液中原蟲(chóng)和細(xì)菌的數(shù)量隨日齡而不斷增加，其中原蟲(chóng)數(shù)量的增加多于細(xì)菌，在135日齡后原蟲(chóng)和除大桿菌外各種細(xì)菌的數(shù)量都已基本穩(wěn)定。?

　　日糧中可消化能水平主要影響瘤胃液中原蟲(chóng)的數(shù)量，而對(duì)細(xì)菌的數(shù)量無(wú)顯著影響。日糧的蛋白質(zhì)水平對(duì)羔羊瘤胃液中原蟲(chóng)和除大桿菌外其它各種細(xì)菌數(shù)量影響不顯著。