1 生物學效價的概念
生物學效價也稱“生物學利用率（Bioavailability）”。Sibbald(1987)指出，生物學效價本身是一個抽象的概念，可以給出定義而無法直接測定。這一概念具有多重涵義。張子儀(1994)指出，生物學效價包括消化率、代謝率、同化、有效性和可利用率等多重涵義。一種營養素的生物學效價是指該營養素被動物食入后，被小腸吸收并能參與代謝過程，貯存在動物體內的部分占食入總量的比值，可概括為相對利用率和絕對利用率。
2 飼料礦物質微量元素生物學效價的評定方法
評定飼料礦物質微量元素生物學效價不僅涉及到不同動物、不同生理條件、各種形態的礦物質微量元素的代謝過程，還受控于不同元素之間的互補、拮抗的規律，所以，評定其生物學效價較評定能量、蛋白質生物學效價要困難得多。目前評定礦物質微量元素生物學效價方法有4種，即平衡試驗法、參比法、同位素法和細胞生物學的應用法。各種評價方法都有優點和缺點，應根據不同的情況和試驗目的選擇合適的評定方法。
2.1 平衡試驗法
平衡試驗法即通過在一定時間內測定動物對元素的食入量和排出量，從而得到被動物吸收或利用的量。Ammerman(1995)將這種評定方法命名為“表觀吸收率（apparent absorption）評定法”，即表觀吸收率（%）=（某元素攝入量-糞中某元素排出量）/某元素攝入量。 該方法原理簡單，所需試驗設備也不復雜，因此，在一段時間內該法應用比較廣泛。但是，隨著研究的深入，該法的缺點也逐漸暴露出來。一方面，此法獲得的礦物質元素的吸收率不一定能反映深層次生物學效價。Sealand Heston(1983)報道，2-吡啶羧酸能顯著提高大鼠對鋅的吸收率（約60%），但同時尿中的鋅排出量也隨之增加，盡管鋅的“表觀吸收量”增加了，但鋅的凈沉積率卻沒有改變。另一方面，糞是內源性Mn、Fe、Zn和Cu等元素的主要排出渠道。綜合以上兩方面，用“表觀吸收率”來表示某元素的生物學效價具有很大的片面性。雖然可以通過延長試驗期、增加動物數量來提高試驗的精確性，但需消耗大量的人力、物力和財力。盡管平衡試驗評定方法存在很多缺點，但它畢竟是經典的測定表觀吸收的方法。使用該方法時，動物處于自然生長狀態，其試驗結果最接近動物自身狀態，對生產實際具有指導意義，是與其它研究方法相比較的參照基準。
2.2 參比法
參比法是一類評定相對生物學利用率的方法，包括斜率比法、三點法、標準曲線法、平均值比法等。參比法原理是基于考察的效應與待評定物和標準物的添加量具有線性關系。通常選用利用率高的物質作為標準物，然后考察標準物和待評定物的添加效應，根據兩種物質的效應進行比較，從而求出待評定物相對于標準物的生物學利用率。標準物一般選擇利用率高的物質，如評定鋅的生物學效價通常采用硫酸鋅和氧化鋅等；評定錳時采用水合硫酸錳；評定鐵時采用硫酸亞鐵；評定銅時采用五水硫酸銅。
2.2.1 斜率比法
斜率比法以其靈敏、準確、客觀而成為評定微量元素生物利用率最常用的方法。它簡單易行，適用于各種元素生物學利用率的測定，且采用多元線性回歸法比簡單線性回歸法更精確，但所測定的結果是相對利用率，需要設定一定的濃度梯度，要求試驗動物較多。該法基本原理是假設反映指標（Y）與被測元素在飼糧中的含量（X）呈線性關系（Y=i+bx），當被測物質(at)與標準物質(as)在x=0相交時，即at=as，則bt與bs的比值即為被測物質相對于標準物的生物利用率。多種來源同時進行比較時，多元線性即回歸方程中相應化合物的斜率與參比標準物的斜率比，即為該元素源相對于參比標準物的生物學利用率。趙劍(2002)采用斜率比法，以肝臟鋅濃度為判定指標，以硫酸鋅為參比標準物的研究表明，氨基酸螯合鋅的生物學效價為100%。Cao(2000)以羔羊肝臟鋅濃度與日糧中鋅添加量線性回歸的斜率來評定，結果表明，賴氨酸螯合鋅的生物學效價為硫酸鋅的110%。Hahn(1993)采用斜率比法研究了高水平添加(含鋅>1 000mg/kg)下，氧化鋅、賴氨酸螯合鋅和硫酸鋅的生物學效價。以硫酸鋅為標準物，以血漿鋅為判斷指標，氧化鋅、賴氨酸螯合鋅的相對生物學效價分別為56%、110%。Lewis (1995)用豬研究并測得蛋氨酸螯合鐵的相對生物學效價為68%(血紅蛋白為判斷指標，硫酸亞鐵的相對生物學效價為100%)。Cao(1996)以肝臟鐵濃度為判斷指標，在肉仔雞的試驗研究中表明，蛋氨酸螯合鐵的相對生物學效價為88%(硫酸亞鐵為100%)。前人對有機錳源生物學利用率的研究，也多采用添加大劑量錳（以骨灰錳含量為指標）來評價有機錳源的生物學利用率。Fly等(1989)以飼料級氧化錳為標準參照物，在不含植酸和纖維的酪蛋白-葡萄糖飼糧中或在上述飼糧中加入10%的玉米-豆粕混合物后的飼糧中添加蛋氨酸錳，結果添加蛋氨酸錳組脛骨灰錳含量均比添加飼料級氧化錳的對照組高30%～74%。但是，不同的研究者因試驗背景不盡相同，得到的微量元素的生物學效價差別也很大。可能主要有以下幾個原因：①試驗所用日糧類型不同；②試驗研究持續的時間不同；③試驗動物的種屬和生長階段不同；④試驗動物體內微量元素貯量背景不同；⑤所選的微量元素產品的種類和質量不同；⑥研究者所選統計處理方法不同；⑦研究中所用評價指標不同；⑧試驗設計時所設定的微量元素的添加水平的高低不同。
2.2.2 三點法
三點法是當已知某指標在一定的范圍內與被測元素在飼糧中的含量呈線性關系時，取x=0和在此范圍內的任意點分別測定參比標準物和待測物的反映量Y，由此作出的兩條直線的斜率比來計算被測物質的相對生物學利用率。這種方法設定含量梯度僅為兩個，試驗簡單，但必須有足夠的前提條件做保證。
2.2.3 標準曲線法
標準曲線法是用不同梯度的標準源作標準曲線，選線性回歸范圍內的一點做為被測樣品的試驗點，制作被測樣品的線性方程，同樣根據兩條直線的斜率比來計算被測源的生物學利用率。
2.2.4 平均值比法
平均值比法適用于兩種或多種微量元素作比較，但缺乏共同的對照點(x=0)時，可選用反映指標平均值相比的方法。當添加元素占飼糧中該元素的主要比例時，該法精確度高；如果占的比例很少時，則意義不大(Littell等，1995)。
2.3 同位素法
1896年人類就發現了天然放射性核素，1924年Gorge De Hevesy第一次將放射性同位素應用于動物研究，但直至20世紀50年代，放射性同位素法才廣泛應用于動物代謝和臨床研究[27，28]。放射性同位素法是通過測定標記礦物元素在體內組織中的貯存含量來測定礦物元素生物學利用率。這種方法可以反映微量元素在體內的分布情況，主要優點表現為:①靈敏度高，放射性的檢測水平可達10-18～10-19g，而普通化學分析法的靈敏度只有10-12g；②可以在整體正常生理條件下進行研究；③操作簡單，樣品可直接測定，不需要繁瑣的前處理；④放射性核素的引入量低，比較接近動物體正常的生理狀態；⑤試驗期大大縮短。放射性同位素法大大提高了試驗的準確性，平衡試驗中若引入放射性同位素，可以測定鋅的真吸收率。Judith(1986)采用65Zn平衡試驗測定了老年人鋅的真吸收率為17%；而年輕人為31%。 Weigand[(1980)給大鼠每千克體重飼喂56～141mg范圍的6個水平鋅，發現鋅的真吸收率隨鋅水平的升高而增加。從理論上講該法最理想，但要求一定的設備，飼料成本也高，雖然在測定飼料原料中礦物元素生物學利用率方面應用廣泛(ODell, 1984、1985)，但在有機微量元素生物學利用率測定方面應用不多，只有Hill等(1987)利用腸灌注法測定了蛋氨酸鋅對雞和豬的生物學利用率，這可能與有機微量元素添加劑在普通飼糧中測吸收率的準確性不高有關。將同位素法與其它試驗方法結合起來，可更準確的研究微量元素的吸收、利用和影響因素，總結前人的研究方法，可將同位素法分為體外法和體內法兩類。
2.3.1 體外法
體外法主要有兩種：外翻腸囊法和小腸刷狀緣膜微粒(Brush Border Membrane Vesicles， BBMV)法。
2.3.1.1 外翻腸囊法
外翻腸囊技術是在體外培養腸環技術上發展而來的，即從活體取出將要研究的腸段，分割成不同的片段，將各片段外翻做成囊狀物，放入培養液中培養一段時間后，取出放進裝有被測物的燒瓶中，觀測腸道粘膜、漿膜及腸體中被測物的變化。由于同位素法的應用，才使應用外翻腸囊技術研究成為可能。Manis和Schachter (1962)首次用外翻腸囊技術研究了小腸對鐵的吸收。Hopping(1963)用此技術研究螯合劑對59Fe被大鼠吸收和在體內分布的影響后指出，外翻腸囊技術是研究鐵吸收的一種有效方法。Emes (1975)采用外翻腸囊技術研究了大鼠小腸鋅最大吸收部位。Seal(1983 )則用該方法研究了鋅吸收的影響因素。該方法操作簡單、快速且耗費低，能詳細地觀察到元素進出腸粘膜的變化規律，從而使人們能夠深入地了解微量元素在小腸內被吸收的特點。但該方法是在沒有血液供應的非正常生理條件下進行的，腸粘膜沒有營養供應，試驗結果只能表示攝入而非吸收。我們不可能完全模擬體內的生理條件進行培養，因此，此時小腸的功能不能正常發揮。
2.3.1.2 小腸刷狀緣膜微粒(Brush Border Membrane Vesicles， BBMV)法
該法是將所研究的腸段取出后，輕輕刮下粘膜，經離心等一系列的處理得到刷狀緣膜微粒，刷狀緣制品的純化程度可通過蛋白和特殊酶活的測定來判定。刷狀緣制品在培養液中培養一段時間后，快速過濾，通過測定濾紙上的放射性元素來估測刷狀緣對微量元素的攝入。Menard (1983)應用該技術研究不同鋅濃度下，鋅的攝入及體內鋅貯對刷狀緣膜鋅吸收的影響，發現鋅的吸收在0.2mmo1/l時是飽和的，在1mmol/l時是不飽和的。刷狀緣鋅轉運系統受動物體內鋅貯的影響。
2.3.2 體內法 根據被測元素的引入方法，可以將體內法分為兩類：一類是直接采食或通過胃管引入；另一類是小腸灌注，前者主要用于人的研究。Wastney (1986)應用該方法，通過測定糞尿、血液、肝器官等中同位素的放射性，研究了人對鋅的代謝動力學模型及血液鋅池的大小。據報道，通過精確計量的采食或胃管給研究對象投入含Fe的食物，然后測定同位素的全身計數(whole-body counting)、血液及某些器官中同位素的放射性，同時監測一些血液學指標和肝臟、脾臟等器官總鐵濃度，以評價人對鐵的吸收利用情況。 原位結扎灌注技術是指將動物麻醉后，打開腹腔，將試驗腸段兩端結扎，腸段中引入被測元素灌注液，一段時間后，通過測定被測元素的消失率，結扎腸段粘膜上被測元素的放射性，血液組織器官中元素的放射性來估計被測元素的吸收、轉運和利用。Darrell(1965)在其研究中詳細描述了該技術。由于其具有試驗期短(幾分鐘至幾小時)、操作簡單、在動物體內進行等特點，該技術得到研究者的廣泛應用。
2.4 細胞培養技術
細胞培養是指人為地從體內取出細胞，模擬體內生理環境，在無菌、適當溫度和一定營養條件下，使細胞能夠繼續生存、生長、繁殖并維持結構和功能的實驗技術。運用細胞培養進行研究有其獨特的優點[4，34]：①離體培養細胞脫離了有機體復雜的環境因素的影響，可以很方便地控制試驗條件，進行單因子測試；②細胞均質，類型單一，對外界影響的反應一致；③可供比較不同因素或同一因素不同劑量對同一種細胞的作用；④細胞可直接暴露在預測試劑中，細胞發生的變化可以直接被觀測，及時反映出來。 盡管細胞培養技術有很多優點，但在人工培養環境下的細胞反應和體內細胞環境相比畢竟有很大差異，所以不應視為與體內細胞完全一樣。國外研究者將細胞培養與同位素示蹤技術有機結合用于研究，已經獲得成功。有研究者利用CACO-2細胞(A human colonadenocar-cinoma cell line)在有牛胎兒血清存在的條件下，研究了鋅的攝入和跨細胞運動，結果表明，鋅在細胞兩側跨細胞速度不一樣，頂膜(Capical )鋅攝入是非飽和的，而基底側(baso cateral)對鋅的攝入是飽和的。
近年來，由于我國細胞生物學技術發展迅速，同時借助于同位素示蹤技術，使得將細胞培養技術用于動物營養研究中成為可能。但是，關于這方面的報道甚少，分析其原因可能是技術含量要求高，要求的試驗儀器昂貴、費用大等，所以，到目前為止還很難推廣應用。 綜上所述，研究礦物質微量元素生物學效價技術具有多樣性，因此，所需條件也各不相同。鑒于此，研究者應根據自身的研究目的和所具備的試驗條件來選擇試驗方法。近年來，結合放射性同位素示蹤技術是研究微量元素在動物體內吸收利用、分布特點及影響因素行之有效的方法。但是，同位素示蹤技術要求測試設備昂貴，標記物來源有限，還有安全問題等，使其利用受到限制。但隨著科學技術的發展、綜合性學科的出現以及各國研究者堅持不懈的努力，在不久的將來，必將克服這些缺點，使之得到更廣泛的應用。必將研究出具有操作更簡單、結果更準確、費用更低廉等優點的測定微量元素生物學效價的方法。
3 影響微量元素吸收利用的因素
近年來，人們對影響微量元素吸收利用的因素進行了大量的研究和探討。借助于一些新技術(如同位素示蹤技術、組織培養技術、細胞培養技術)和手段(放免分析)，人們對影響微量元素吸收利用因素的研究進展迅速，歸納起來主要有飼料方面、動物自身方面、評定指標的選擇和微量元素的化合物形式方面。
3.1 飼料方面
飼料中礦物質微量元素的含量，還有日糧中的某些成分都會影響微量元素的吸收利用。總結多年來的研究成果，可以把影響因素分為兩類——抑制劑和促進劑。抑制劑如纖維素、植酸、某些礦物元素、某些抗營養因子(單寧、棉酚等)。有研究報道，粗纖維與錳的利用率呈明顯的負相關。一般來說，隨著植酸水平的增加，肉仔雞對錳吸收水平顯著下降。李杰(1992)試驗指出，飼糧中植酸水平為0.8%時，足以使全雞及脛骨中錳含量極顯著下降。飼料中某些礦物元素，如銅、鋅、錳和鈷由于與鐵具有相似的生理生化特性，通過吸收結合位點的競爭，影響鐵的吸收(Underwood， 1977)。在動物機體內，微量元素銅在鐵的代謝過程中起著非常重要的作用[38]。飼料中有些成分對鐵的吸收利用起促進作用，如抗壞血酸(VC)、維生素A、蛋白質及其降解產物、某些氨基酸、某些有機酸和糖類等。研究者早在六、七十年代就已經發現氨基酸和小肽具有促進鋅吸收的作用。較為一致的看法是：氨基酸或小肽可與鋅在小腸中形成可溶的鋅-氨基酸螯合物或鋅-小肽絡合物，該物質在腸段中不受植酸等因素的影響，并能以氨基酸和小肽的吸收模式轉運，提高了鋅的利用率。
3.2 動物自身方面
不同種類動物對礦物質微量元素的吸收利用差異很大。Schricker (1981 )在研究中發現，向日糧中加入VC顯著提高人對鐵的吸收利用，而大鼠表現的沒有那么明顯。Elliott(1977)研究報道了大鼠和仔豬之間鐵吸收利用的差別很大。同種動物不同品種間、同品種不同性別間對鐵吸收利用無明顯差異。有資料證實，動物體內鐵的營養狀況不同，鐵的吸收利用情況也不同；另外，動物的胃腸道環境也影響鐵的吸收。動物的不同生長階段對微量元素利用也有影響，據報道，蛋氨酸鋅對肉雞的生長具有一定的促進作用，主要表現在試驗的前期。
3.3 評定指標的選擇
大量的試驗對微量元素的生物學效價的敏感指標進行了研究，不同研究者采用的指標各異，主要有生產性能指標(日增重、采食量和飼料轉化率)、骨骼發育(脛骨)指標、血清指標(血清中無機鋅的濃度、堿性磷酸酶活性、ALP、血清鋅結合不飽和率)、外觀指標等。 生長速度是早期評定微量元素利用率的最基本指標，但為非特異性指標。在測定時通常需要使用純合或半純合飼糧，不僅成本高，而且測定結果不一定適合含有天然原料的實用飼糧。近年來出現的大劑量添加微量元素法使添加量遠遠超過了動物的生理需要量，使生長速度作為微量元素利用率評定指標的準確性更低。特定敏感組織中的礦物元素積累是用斜率比法評定微量元素化合物生物學利用率時最常用的評定指標。許多學者在純合、半純合飼糧中添加低含量微量元素，以組織或血液中該元素的含量評定了有機鋅、有機銅相對于無機硫酸鹽的相對利用率。微量元素在體內的代謝途徑和功能不同，特異性敏感指標也不同[44]。以往的研究表明，采用不同的指標，所得的結果也不同。因此，評定指標的選擇對于評價微量元素的生物學效價特別重要。
3.4 微量元素的化合物形式
微量元素在飼料中的添加形式一般有3種：無機態、有機酸、氨基酸和蛋白質絡合物形式。以鋅元素為例，鋅在體內主要以有機結合態進行吸收、轉運、儲存和利用。無機鋅只有轉化為有機態，才能被機體利用。因此，無機鋅的生物學效價取決其轉化成有生物活性的有機鋅的能力。目前研究最多的是氨基酸螯合鋅。Lowe( 1996)報道，螯合鋅由于其獨特的結構，與無機鋅的吸收機制可能不同。Wedekind的試驗表明，與硫酸鋅(100%)相比，根據日糧的復雜程度，蛋氨酸螯合鋅的生物學效價在117%～206%之間。其它元素關于這方面的報道也很多。但就目前而言研究最多的還是氨基酸螯合物，今后隨著技術的成熟，這種方法必將得到廣泛的應用。
4 小結
隨著科學技術的快速發展，飼料中礦物質微量元素生物學效價的評定方法趨于一致，研究的結果也呈現出一致性，但由于某些因素的存在往往還有一定的差異性。今后的研究應著重分析哪些因素是重要的以及找到最合適的評定體系。也許人們可以從細胞水平和分子水平的研究中為飼料中礦物質微量元素生物學效價的評定找到理想的答案。王 群 劉艷芬
