1 鈣蛋白酶系統的結構及功能

    1.1 鈣蛋白酶結構根據鈣蛋白酶（Calpain）表現半最高活性所需的Ca2+濃度的不同，可以將普遍存在的Calpain分為兩種，一種為μ－Calpain（又稱Calpain Ⅰ）激活所需Ca2+濃度為微摩爾級，另一種為m－Calpain（又稱 Calpain Ⅱ）激活所需 Ca2+濃度為毫摩爾級。它們都由2個亞基組成，其中30 kDa小亞基在2種Calpain中是相同的，是單個基因的產物，而80 kDa大亞基則是木同基因的產物。兩種Calpain都具有水解肌原纖維蛋白的活性。

    比較不同來源的 Calpainc DNA發現，它們具有高度的同源性，盡管μ一Calpain和m－Calpain大亞基氨基酸序列有明顯差異，但其結構是基本相同的，都由4個結構域組成，結構域Ⅰ和結構域的功能還不太清楚，有可能與蛋白酶調控亞基或其他調控蛋白如抑制蛋白、激活蛋白的相互作用有關。而且位于氨基端的結構域Ⅰ，在蛋白酶激活的情況下，很容易發生自溶，由此推測其可能起鈣蛋白酶的活性調節作用；結構域Ⅱ是表現水解活性的關鍵部位，與半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶、組織蛋白酶有相似性；結構域Ⅳ是鈣結合的部位，與其他鈣結合蛋白如鈣調素蛋白（CaM）、肌鈣蛋白（Troponin C）都有明顯的相似性，都含有鈣結合蛋白所特有的4個EF-手結構。

    小亞基含有兩個結構域，兩結構域之間由一段富含脯氨酸的序列連接，結構域和大亞基結構域類似，也有4個EF-手結構，故也具有結合鈣的活性。除了上述兩種普遍存在的Calpain外，還發現了組織特異性表達的Calpain，稱為p 94或nCL－l，其結構與前兩種相似，只是比它們多了3個插入序列，與結構域的同源性比較差。

    1．2 鈣蛋白酶抑制蛋白的結構 鈣蛋白酶抑制蛋白（Calpastatin）是胞內專一抑制Calpain活性的蛋白質，可以識別Calpain與鈣結合引起的構象變化并與之特異性結合。Calpastatin共有5個結構域，其中4個是Calpastatin的活性中心所在，具有相似的重復單位，重復區域具有相當保守的30個氨基酸序列，都包含有Thr－Ile－Pro－Pro-X－Tyr－Arg，因此它可能是Calpastatin起作用的關鍵部位。X代表不同的氨基酸，對CalPastatin的活性具有重要的作用。

    1．3 鈣蛋白酶系統結構與活性關系 當Calpain的大小亞基相結合時，不具有活性。Yoshizawa等（1995）發現，Calpain）經 Ca2+激活后，其大小亞基分離，因此認為小亞基有可能主要起調節的作用，大亞基起催化調節作用。分離后30 kDa小亞基迅速降解為17 kDa，而這一變化是Calpain發揮水解特性的前提（Dorothy等，1992）。80 kDa的 Cal－pain一般不具有活性，當其先轉化成78 kDa再變成76 kDa的自溶形式時方具有活性，且迅速降解而失去酶活性（Geert，1999）。由于Calpain在自溶后才表現活性，因此可將Calpain看成是一個酶原，而Calpain活性下降則是其發揮水解作用的標志。

    Calpaslatin的分子量大小的報道不一致，但其在宰后肌肉中也會發生降解，且降解后的Calpas－tatin同樣具有抑制Calpain的活性。E.F.Deigado等（2001）研究表明，剛宰后的肌肉中Calpastatin多以125 kDa的形式存在，而3 d后以分子量約為65kDa的多肽形式存在，還具有明顯抑制Calpain的活性，但抑制能力有所下降。

    2 鈣蛋白酶系統對肌原纖維的作用

    從目前研究看，Calpain的作用可能是調節細胞內蛋白質的降解，而非整個降解過程的直接參與者。體外試驗表明，Calpain降解肌原纖維骨架蛋白，如結合蛋白（Desmin）絲蛋白（Filamen）C－蛋白、原肌球蛋白（Tropomyosin）、肌原蛋白T（Tro－ponin一T)、連接蛋白（Titin）、Nebulin、Vinculin等，但不降解α-肌動蛋白（α－Actin）、肌球蛋白（Myosin）及α-輔肌動蛋白（α－Actinin)。因此推測，Calpain可能通過對肌原纖維蛋白進行特異的局部降解而對其結構和功能進行調控（JingHuang，1998）。據推測Calpain導致肌肉降解可分為兩步：首先攻擊肌原纖維的肌節（兩個相鄰Z盤之間的一段肌原纖維）部位，釋放肌絲使降解為小片段，然后被溶酶體所捕獲而進一步降解。

    Calpain主要集中于Z盤，因此認為降解從此處開始。但近期研究發現，Calpain首先水解的是N 2線，據報道N 2線是Titin和Nebulin絲蛋白所在區域，它們分別連接粗肌絲和細肌絲，最終通過I帶伸向Z盤。在降解N2線的同時，也會降解一些骨架蛋白如 Desmin，使肌纖維釋放肌絲。細肌絲的肌原蛋白和原肌球蛋白及粗肌絲的C-蛋白降解，分別解離出肌球蛋白和肌動蛋白。釋放出的粗肌絲和細肌絲可與母體或其他肌原纖維重新裝配，也可被胞質蛋白酶或溶酶體降解。Calpain參與骨架蛋白的降解，是蛋白質水解過程中的限速步驟。

    3 鈣蛋白酶的活性調節

    Calpain的活性調節在體內和體外有所區別，在體內的活性調節了解不多，活性調節研究主要集中于體外試驗中。

    3.1 鈣蛋白酶的激活調節 Calyain是鈣依賴蛋白，只有在Ca2+存在的情況下方有活性，在體現水解活性時大致發生以下4個過程的變化：l）Calpain大小亞基的分離；2）小亞基的自溶; 3）大亞基自溶;4）Calpain構象發生變化而表現蛋白水解酶活性。Calpain受激活后最終呈自溶狀態而表現活性，因此通常把Calpain是否發生自溶看做是Calpain是否已被激活的標志。Calpain受Ca2+濃度調控，高Ca2+濃度能加速Calpain的活化。

    除了Ca2+濃度，Calpain的活性還受離子強度、pH、底物等因素的影響。m－Calpain和μ－Calpain的水解活性隨著離子強度增加而降低，但趨勢并不明顯，這可能是因為酶的聚合或 Ca2+ - Calpain復合物穩定性降低；隨著pH值的增加，μ-Calpain水解活性增加；底物存在時，Calpain的活性下降慢，且不同底物Calpain表現的活性也不同（Mohammad Koohmarate，1992）。其機理還不清楚，可能與Calpain自溶狀態的穩定性有關（Geerr等，1999）。

    3.2 Calpain的抑制調節 Calpain抑制劑有內源性和外源性兩種，其中外源性抑制劑又可分為過渡類似物和不可逆抑制劑等。

    3.2.l 不可逆抑制劑及作用原理 這些抑制劑可以以共價鍵的方式與酶的某些基團牢固結合，而使酶失去活性。Calpain是1種含巰基的酶，因此碘乙酸、碘乙酰胺、E－64等對Calpain可發生不可逆抑制作用。

    3．2．2 過渡類似物抑制劑及原理μ－Calnain和m－Calpain作用于底物的特異性切割位點大部分是一致的，大量試驗表明Calpain切割位點P1最佳為精氨酸、組氨酸、酪氨酸或甲硫氨酸殘基，P2最佳為亮氨酸或纈氨酸殘基，且P2被認為是決定位點。但切割位點是由多個因素決定的，如切割位點兩端的氨基酸殘基、離切割位點附近的氨基酸殘基和底物的其他結構特征等。李昭昭（1995）改變二肽P1位氨基酸殘基、末端氨基保護基、酯基，發現這些改變都會引起抑制能力變化，證實了前者的說法。根據這些特性，研究者人為地合成一些多肽以抑制 Calpain的活性，如 Leupeptin（丙酸基／乙酸基一L－Leu－L－leu－L一arg)、三肽氯甲基酮（Leu－Leu－Phe／Lys／Tyr－CMK）、二肽、三肽α一酮酸酯（Ph2CHCO－Leu－Abu－COOEt，2－NapCO－Leu－Leu－Abu－COOEt)。這些多肽對Calpain的抑制能力都大于典型的氯甲基酮抑制劑如Tosyl－Phe－CH2Cl。這可能是因為它們在P2位點都含有亮氨酸，這說明P2位氨基酸殘基是Calpain重要的識別位點。

    3.2.3 Calpastatin的調節Calpastatin是高效的，十分專一的Calpain活性抑制蛋白。當Calpain被Ca2+激活后，如果附近有Calpastatin存在，將迅速與之結合而抑制Calpain活性，從而保證Calpain對底物只進行局部的特定位點的水解。這可能是源于Calpastatin對μ-Calpain的自溶穩定性的影響。80 kDa亞基的μ－Calpain首先轉化為78－kDa，然后轉化為76－kDa的自溶產物，再進一步自溶而失活。Calpastatin能抑制μ－Calpain一系列的變化，且呈劑量依賴性關系。而自溶作用是鈣蛋白酶表現活性的重要步驟，由此可見Calpas－tatin是通過抑制Calpain的自溶作用而發揮作用的，且這種抑制作用并不受pH的影響（Roman等，1999）。

    4 鈣蛋白酶系統與嫩度的關系

    宰后肉的嫩化現象是非常普遍的，Calpain表達減少以及Calpastatin表達量的增加都會導致肌肉蛋白水解率及宰后肉嫩度的下降，這表明Cal－pain水解作用是導致肉嫩化的主要因素。μ－Calpain和m－Calpain都能水解肌原纖維，但在宰后成熟的過程中m－Calpain的活性幾乎不變，而μ－Calpain的活性則顯著下降。鈣蛋白酶活性下降，則是其發揮水解作用的體現，因此人們普遍接受μ－Calpain而不是m－Calpain參與了肉的嫩化，這可能是因為活體細胞內的Ca2+濃度太低（100μmol）不足以激活m－Calpain（Whipple和Koohmaraie，1991)。同時 Calpastatin也參與了肌肉嫩化過程，其活性也隨時間的增加而降低。

    鈣蛋白酶系統調節肌肉嫩化具體機制還不是很清楚。Delgado等（2001）研究發現，肉的嫩化與Calpastatin活性及降解速度有關，而與μ－Calpain、m－Calpain的活性及降解速度沒有明顯的關系。Pringle等（1997）用Angus（A）和Brahman（B）及其雜交牛為對象做試驗研究，表明μ－Calpain的活性與嫩度具有相關性，而Calpastatin活性與嫩度的相關性并不很明顯。試驗還表明，在鈣蛋白酶系統中與嫩度最高度相關的是Calpastatin與μ－Calpain活性的比值。Ilian等（2001）研究發現，除了μ－Calpain與肉嫩度有關外，肌肉組織特異表達p94對嫩度影響也很大，其mRNA水平與肌肉的相對嫩度具有高度相關性[（bovine）＝0．522，r（ovine）＝0．706]。而 Parr等（1999）研究表明，p 94與豬背最長肌的嫩度并沒有直接的關系。

    綜上所述，鈣蛋白酶系統的確在肉的嫩化過程中起著至關重要的作用，但究竟是哪個酶在這過程中起決定性作用報道并不一致。這可能是因為：1）鈣蛋白酶系統是一個復雜的、高度調控的蛋白降解體系；2）所用的試驗方法的不一致；3）各酶的不穩定性，在提取過程中活性的降低。

    5 與Calpain活性有關的幾種物質對肉嫩度的影響

    5.1 CaCl2對肉嫩度的影響 Calpain受Ca2+濃度的激活，而活體細胞內的Ca2+濃度一般不能激活m－Calpain。CaCl2能使肉變嫩的原因，可能是其能夠同時快速激活肌肉中μ－Calpain和m－Calpain的活性，且克服了Calpastatin抑制作用，研究發現鈣能降低Calpain系統中各酶的活性。μ－Calpain和m－Calpain的活性降低說明其對肌原纖維的水解增加，Calpastatin活性降低則說明其抑制Calpain的能力下降。Whipple等(1993）指出，這有可能是因為在鈣濃度足夠高的情況下能激活m－Calpain，能增加Calpastatin的水解從而使Cal－pastatin的調節能力降低。Pringle等（1999）在肌肉中注射CaCl2以研究其改善肉嫩度的情況，結果表明CaCl2能同時降低Calpain系統中3種酶的活性，μ－Calpain、m－Calpain和Calpastatin的活性分別降低了75％、77％和 34％，而相應的肉的剪切力都明顯的下降，因此認為鈣能激活鈣蛋白酶系統從而改善肉質。但肉嫩度提高的程度，與肌肉的類型與品種有很大的關系。A型牛比B型牛嫩度要提的高些，不同部位肉的嫩化程度也相差很大。

    5．2 維生素D3（VD3）對肉嫩度的影響 Swanek等（1999）研究發現，VD3能夠明顯改善宰后牛背最長肌的嫩度，屠宰前7d飼料中添加5×106IUVD3的牛與對照組相比，其背最長肌的剪切力下降了0．58 kg。這有可能是因為 VD3能夠動員骨骼中的鈣，刺激小腸中鈣的吸收以及促進腎小管重吸收鈣，從而使血清中Ca2+的濃度增加所致。且VD3還能通過激活Ca2+的通道，增加Ca2+在骨骼肌中的流量，最終使骨骼肌中鈣的濃度升高約0．53 mmol。此時Ca2+的濃度足可以激活鈣蛋白酶系中的Calpain，導致肉嫩度的提高。

    5．3 焦磷酸鈉（NaPPi）對肉嫩度的影響 NaPPi含有多個陰離子，具有很強的緩沖能力（pH 6．5～9．0），能緩和肉中pH值降低的趨勢，提高肉成熟過程中的pH值。Lee等，（2000)發現，在宰后的肉中注射NaPPi，能顯著改善肉的嫩度，與其提高肉的州值密切相關。NaPPi還能提高離子強度和降低肉的溫度，這些都能增進Calpain的激活，提高水解蛋白的能力從而提高肉的嫩度。

    6 結論與展望

    鈣蛋白酶引起肌肉中蛋白質的水解，是導致宰后肌肉嫩化的主要原因，這已成定論。因此，可以通過激活Calpain或降低Calpastatin活性的方式提高肉的嫩度，改善肉質。但總的來說，鈣蛋白酶系統的具體調控及生理功能還不很清楚，哪種酶在嫩化過程中起主要作用還需通過分子生物學技術等相關手段加以研究。