抗生素作為抗菌促生長添加劑加到飼料中由來以久，但其廣泛和大量使用導(dǎo)致動物性食品中藥物殘留等問題愈來愈令人擔憂。因此尋找一種安全、環(huán)保的新型飼料添加劑以成為當務(wù)之急。近年來，乳鐵蛋白（Lactoferrin，簡稱LF）成為當今乳品界和食品界最為關(guān)注的“熱點”之一。大量研究表明：乳鐵蛋白具有抗菌、抑菌、抗病毒、抗氧化和調(diào)節(jié)機體免疫等作用，可用于開發(fā)新型的保健食品和綠色飼料添加劑。
乳鐵蛋白（LF）是一種天然的鐵結(jié)合蛋白，乳鐵蛋白活性多肽（Lfcin）是從LF上被胃蛋白酶水解下來的25個氨基酸殘基的小肽。乳鐵蛋白存在于人奶及大多數(shù)哺乳動物的奶中（馬、牛、山羊、豬、兔、小鼠等），也存在于唾液、精液、淚液、氣管、鼻腔分泌物、胰液以及其它的身體分泌物中。乳來源不同，乳鐵蛋白的含量差異較大。人奶初乳中的乳鐵蛋白濃度最高6～8mg/ml，常乳2～4mg/ml；牛的初乳1～5mg/ml，常乳0.02～0.35mg/ml；狗、大鼠奶中則基本不含乳鐵蛋白。但開發(fā)乳鐵蛋白遇到的最大問題是：制造成本太高，大量制造較困難，難以實現(xiàn)商品化。然而隨著一些生物高新技術(shù)（如：親和色譜分離，膜技術(shù)，基因工程技術(shù)等）得到廣泛的應(yīng)用，完全有可能降低它的成本，使之商品化。目前關(guān)于乳鐵蛋白的許多研究正在進行中，乳鐵蛋白的活性多肽也逐漸引起人們的關(guān)注。本文就乳鐵蛋白及其活性肽的結(jié)構(gòu)，營養(yǎng)生理功能，基因的調(diào)控與表達及開發(fā)與利用進行了展望。
1 乳鐵蛋白及其活性多肽的結(jié)構(gòu)
乳鐵蛋白(Lactoferrin，簡寫為LF)是Groves于1960年首先從牛乳中分離獲得，由于LF與鐵結(jié)合形成紅色的復(fù)合物，故始稱為紅蛋白。Blanc和Isliker（1961）將他們從人乳液分離出來，正式命名為乳鐵蛋白。乳鐵蛋白是一種鐵結(jié)合性糖蛋白，其分子量為80ku。1分子乳鐵蛋白中含有2個鐵結(jié)合部位，含有15～16個甘露糖，5～6個半乳糖，10～11個乙酰葡萄糖胺和1個唾液酸。牛和人的乳鐵蛋白分別含有689和691個氨基酸，其中谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸和丙氨酸的含量較高，除含少量半胱氨酸外，幾乎不含其它含硫氨基酸。牛乳LF和人乳LF兩者的三維結(jié)構(gòu)非常相似，約有70％的氨基酸序列相一致。LF的二級結(jié)構(gòu)呈2枚“無柄銀杏葉并列狀”，鐵離子的結(jié)合點位于兩葉的切入部位，每個點可結(jié)合1個Fe3+和1個HCO或CO32-。
乳鐵蛋白活性多肽是乳鐵蛋白在酸性條件下的降解產(chǎn)物,其抗菌活性明顯提高。從乳鐵蛋白分子的N端進行分離,可分別得到牛和人乳鐵蛋白活性多肽,分別稱為lactoferrcinB和lactoferrcinH。牛乳鐵蛋白活性多肽（LfcinB）是從BLF的N-端（17～ 41）被胃蛋白酶水解下來的25個氨基酸殘基的小肽，其中的11個氨基酸殘基具有與完整的LfcinB相同的抗菌活性。11個氨基酸殘基中的6個（4～9）是LfcinB的活性中心。而人乳鐵蛋白活性多肽含有47個氨基酸殘基,序列與lactoferrcinB具有一定的同源性。
LfcinB的二級結(jié)構(gòu)是在一級結(jié)構(gòu)的肽鏈上折疊而成。Schibi等（1999）通過核磁共振技術(shù)對LfcinB的活性中心的結(jié)構(gòu)進行研究發(fā)現(xiàn)， LfcinB是兩性分子結(jié)構(gòu)，堿性的Arg 殘基和疏水的Trp殘基充分分離形成了兩性分子結(jié)構(gòu)，Arg殘基在分子的一側(cè)，Trp殘基在分子的另一側(cè)，Gln在分子的中間。這種結(jié)構(gòu)與LfcinB的抗菌和抗病毒功能分不開。
2 乳鐵蛋白及其活性多肽的營養(yǎng)生理作用
2.1 殺菌、抑菌作用
1972年，Bullen等首先提出LF具有抑菌作用。1982年，Arno1d等通過螢光免疫研究發(fā)現(xiàn)，LF可與菌體表面結(jié)合，從而隔斷外界營養(yǎng)物質(zhì)進入菌體，致使菌體死亡。現(xiàn)已確定，LF屬廣譜抑菌劑，既可抑制需鐵的革蘭氏陰性菌，如大腸菌群，沙門氏菌等；也可抑制革蘭氏陽性菌。但基本不抑制對鐵需求不高的菌，如乳酸菌。
ＬＦ的另一種殺菌方式是通過一種抗菌活性多肽（簡稱Ｌｆｃｉｎ）。Ｔｏｍｉｔａ等（１９９１年）和Ｂｅｌｌａｍｙ等（１９９２）研究了牛乳鐵蛋白的蛋白酶水解物的抗菌效果， 結(jié)果表明，豬胰蛋白酶水解得到的小分子多肽具有較強的抗菌作用，其抗菌活性是未降解前的２０～４００倍以上 。
Hwang等（1998）研究了LfcinB溶液的三維結(jié)構(gòu)，利用核磁共振(NMR)的X衍射分析發(fā)現(xiàn)，LfcinB的空間構(gòu)象為扭曲的反向平行的β-折疊。對照LF的X衍射分析，LF的結(jié)構(gòu)為α-螺旋結(jié)構(gòu)。由此可以解釋正是由于α-螺旋結(jié)構(gòu)向β-折疊的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致了LfcinB的抑菌活性強于LF，因為β-折疊構(gòu)象更易于貼近細菌的表面，從而有了更多與細菌接觸的機會。
以前有人認為LF和LfcinB對革蘭氏陰性菌和陽性菌的抑菌作用是由于乳鐵蛋白高度結(jié)合鐵，使細菌失去生長所需的基本元素鐵。但現(xiàn)在研究發(fā)現(xiàn)，許多微生物通過分泌小分子鐵絡(luò)合物或通過分泌LF的受體來與LF競爭鐵。其真正的抗菌作用是通過直接對細菌或病毒的作用，或通過其水解的多肽對細菌或病毒的殺傷作用。特別是BLF可通過水解得到的LfcinB來實現(xiàn)。及LF通過氨基末端強陽離子結(jié)合區(qū)域，增加細菌細胞膜的通透性，使細菌的脂多糖從外膜滲出，達到直接殺菌作用。Schibli等（1999）對LfcinB的活性中心的研究顯示，位于一側(cè)的2個疏水的Trp殘基和另一側(cè)3個帶正電荷的Arg 殘基與細菌或病毒細胞結(jié)合，其中疏水的Trp殘基起著膜定位器的作用。第一步是帶正電荷的Arg 殘基與膜上磷脂基團的陰離子之間的相互作用，接著跟膜上的脂多糖相互作用，然后通過膜定位器Trp的作用，使肽分子的疏水α-螺旋插入膜上，聚合形成孔道，導(dǎo)致內(nèi)容物外泄，細菌或病毒死亡。隨后的一些研究證明了LF抑菌效果均與LF結(jié)合鐵的能力有關(guān)，乳鐵蛋白及其活性肽的抑菌作用取決于鐵離子的飽和程度,它們與鐵離子的飽和程度越高，抑菌活性越弱。
2.2 抗病毒作用
Shimizu等（1996）對小鼠在注射細胞肥大包涵體病毒前注射乳鐵蛋白,可以提高動物對病毒致死的抵抗力。LF能抑制人HIV-l（免疫缺陷病毒-1）和HCMV(巨細胞病毒)對MT4細胞和成纖維細胞的致病變作用，其抑制濃度（IC50）分別為30～100μg/m1和40μg/m1，牛乳LF抑制病毒的活性約為人乳LF的2．5倍。乳鐵蛋白及其活性多肽可以抑制胃腸炎病毒、肝炎病毒、皰疹I(lǐng)型和II型病毒、流感病毒等，即使是攜帶HCMv病毒的母乳哺喂的嬰兒，在最初的1個月內(nèi)也不易感染，主要是因為初乳中LF含量甚高；而隨著母乳中LF水平的下降，約有2/3的嬰兒在此后的8個月內(nèi)存在感染危險。最近，日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)LF具有防止健康細胞受丙型肝炎病毒感染的作用。研究人員把丙肝病毒和牛LF添加到肝臟細胞中一同培養(yǎng)，8d后檢查發(fā)現(xiàn)，肝臟細胞未受丙肝病毒感染。通過臨床試驗證實牛奶中的乳鐵蛋白能使丙型肝炎病毒減少，有望成為治療丙肝的一種輔助療法。乳鐵蛋白與鐵離子的飽和程度也影響抗病毒活性,處于飽和狀態(tài)的乳鐵蛋白,抑病毒活性明顯下降（Hanson等，2000）。關(guān)于LF抗病毒的機制，有一種解釋是LF能與病毒或宿主細胞相結(jié)合，從而阻斷了病毒與宿主細胞間的結(jié)合，使后者免受病毒的危害。
2.3 調(diào)節(jié)機體免疫
嗜中性細胞、巨嗜細胞和淋巴細胞表面都具有乳鐵蛋白受體,而血清中的乳鐵蛋白主要是由嗜中性細胞釋放出來的[9]。嗜中性粒細胞是含乳鐵蛋白最多的細胞，在機體受感染時可以將乳鐵蛋白釋放出來，釋放出的乳鐵蛋白奪取致病菌的鐵離子致使后者死亡。用牛乳LF治療貓的口腔炎，發(fā)現(xiàn)嗜中性粒白細胞的活性被明顯激活。連續(xù)4周給老鼠進食LF能刺激其腸道和脾臟分泌IgA和IgG。體外模擬試驗和用鼠類動物、小豬等所作的試驗均證實，LF具有調(diào)節(jié)免疫的功能，能促進抗體生成、T細胞成熟、淋巴細胞增殖、活化自然殺傷細胞(naturalkiller)、抑制混合淋巴球的IL-1，IL-2以及腫瘤壞死因子（TNF）的釋放等（Appelmelk等，1994）。
上述現(xiàn)象機制尚不十分清楚。但也有了一些研究，譬如NK細胞活性的增強已知是由于乳鐵蛋白和NK細胞的靶分子之間存在結(jié)構(gòu)同源性，還有乳鐵蛋白同細菌脂多糖（LPS）結(jié)合后引起LPS介導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生減少可能是先前報道的乳鐵蛋白可防止小鼠試驗性大腸桿菌敗血癥的發(fā)生的原因。Broek 等（1995）報道乳鐵蛋白可通過調(diào)節(jié)鐵離子攝取量而影響T細胞增殖，當鐵離子處于低水平時T細胞增殖受抑制，反之則T細胞增殖受到刺激。有人提出乳鐵蛋白在炎癥部位可通過同組織損傷產(chǎn)生的具有潛在毒性鐵離子結(jié)合而對T細胞功能起到保護作用。還有人認為乳鐵蛋白同單粒細胞和巨噬細胞的結(jié)合可能也能起到類似的保護作用。
乳鐵蛋白在炎癥反應(yīng)，感染以及免疫中的作用究竟如何？至今尚缺乏明確的答案，就目前來說已有可能對中性粒細胞脫顆粒產(chǎn)生的乳鐵蛋白對炎癥免疫反應(yīng)一系列作用做出一定的設(shè)想。由于乳鐵蛋白可與細胞表面酸性分子結(jié)合，它能同淋巴細胞、巨噬細胞等細胞結(jié)合從而防止它們免受由于組織損傷而釋放的自由基對它們的損傷。當乳鐵蛋白與鐵離子結(jié)合后，它對蛋白酶的降解作用更具抵抗力，同時使病原微生物可利用的鐵離子大為減少。此外這種更為穩(wěn)定的鐵離子-乳鐵蛋白復(fù)合物可隨后對抗感染有關(guān)的基因進行轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)，或通過其它機制發(fā)揮抗感染作用。
2.4 抗氧化作用
機體內(nèi)氧自由基過剩，形成過氧化脂質(zhì)，可損傷細胞和組織，是衰老或疾病的征兆。通常只要有痕量的鐵或銅等催化劑存在，就會導(dǎo)致氧自由基的產(chǎn)生。較早以前，就有人報導(dǎo)在pH值為7．4的NaCl溶液中，飽和度為20％的乳鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白抑制了牛腦磷脂脂質(zhì)體的抗壞血酸鐵鹽催化的磷脂過氧化反應(yīng)。在同樣的體系中，不同鐵飽和度的白蛋白都不能抑制該反應(yīng)。因為乳鐵蛋白能結(jié)合鐵離子，進而阻斷鐵離子導(dǎo)致的脂質(zhì)氧化和氧自由基的生成轉(zhuǎn)變。牛乳鐵蛋白能抑制抗壞血酸和色氨酸的氧化(Bihel等,1998)。于是，可認為LF的抗氧化機制主要是整合了易引起氧化的鐵離子。Huang等（1999）報道了乳鐵蛋白在不同食品體系中抑制磷脂氧化情況。以玉米乳濁液和磷脂脂質(zhì)體為研究對象，前者在磷酸和檸檬酸緩沖乳狀液體系中、LF的抗氧化活性隨其濃度增加而增加，而磷脂脂質(zhì)體在此二者體系中結(jié)果卻不一樣。在檸檬酸緩沖的乳狀液以及磷酸緩沖的脂質(zhì)體體系當中，1μmol/l乳鐵蛋白和0.5μmol/l Fe2+混合物的抗氧化活性要比單一lμmol/l乳鐵蛋白強得多。總之，乳鐵蛋白的抗氧化活性主要依靠于磷脂體系、緩沖條件、濃度、金屬離子的存在以及氧化時間。
2.5 提高腸道細胞對鐵離子的吸收
LF作為一種鐵強化劑，其吸收效果遠優(yōu)于FeSO4或Fe2（SO4）3。據(jù)Kawakami(1988)報道，給貧血小豬喂食LF和FeSO4，后者的攝入量需達到前者的4倍(200μg/50μg)，才能產(chǎn)生相同的治療效果。可能是母乳來源的鐵具有高生物利用率的重要原因。因為乳鐵蛋白通過它的氨基和羧基末端兩個鐵結(jié)合區(qū)域能高親和性地，可逆地與鐵結(jié)合，并維持鐵元素在一個較廣的pH范圍內(nèi)而完成鐵在十二指腸細胞的吸收和利用。乳鐵蛋白能提高鐵在動物腸道中的吸收率,所以母乳喂養(yǎng)的新生動物貧血病發(fā)病率顯著降低。LF發(fā)揮功能的前提是不被降解，研究證明， 嬰兒出生后第ld，LF的降解率非常低，其后逐漸升高，出生后6～12周，母乳中LF 99％被降解，這時它就只能作為一種營養(yǎng)源被利用了。在補充鐵劑時如能同時增補LF，則可明顯減緩鐵離子對腸道的刺激作用，保護腸道。乳鐵蛋白能在動物腸道螯合鐵離子可明顯降低鐵離子對動物腸道的刺激作用。在腸道中,乳鐵蛋白結(jié)合鐵離子的能力是鐵蛋白的260倍。由于母豬乳中乳鐵蛋白含量較低,因此仔豬的缺鐵性貧血一直是營養(yǎng)研究中的難點。通過日糧補充外源性乳鐵蛋白,降低仔豬缺鐵性貧血的方法值得研究。
2.6 其它幾種生理活性功能
乳鐵蛋白能同多種抗生素和抗病毒藥物協(xié)同作用，減少藥物用量，降低抗生素或抗真菌制劑對人體肝、腎功能的損害。同時，增強體內(nèi)微生物對藥物的敏感性。LF促進腸道有益菌群生長，乳鐵蛋白導(dǎo)致動物腸道中雙歧桿菌和乳酸桿菌等有益菌群的生長,抑制有害菌群。乳鐵蛋白具有抗癌作用，乳鐵蛋白對消化道腫瘤，如結(jié)腸癌、胃癌、肝癌、胰腺癌，具有化學(xué)預(yù)防作用，并可抑制由此引發(fā)的腫瘤轉(zhuǎn)移。
3 乳鐵蛋白的制備
以新鮮脫脂牛乳乳清為原料，通過色譜法、超濾法、鹽析法、酸沉淀法等提取LF。現(xiàn)代化的LF制備技術(shù)是把色譜法和超濾法相結(jié)合，實行工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)，產(chǎn)品純度高達95％。美國一項專利技術(shù)從干酪甜乳清中分離LF，可制得高純度、鐵飽和度為10%的LF。Tomita（2000）報道從奶酪乳清中分離LF，其含量高達100mg/l。
目前利用基因工程，已克隆多種動物的乳鐵蛋白及cDNA序列，并在乳腺，煙草和昆蟲細胞中表達了重組的人乳鐵蛋白。荷蘭PHP公司最近在牛的乳腺中表達了以牛asl-酪蛋白基因5’調(diào)控序列為啟動子的人乳鐵蛋白基因。也有人在細菌和真菌中克隆和表達了人、牛和豬的LF。Ward等和Liang等成功地把人的乳鐵蛋白基因轉(zhuǎn)入米曲霉和啤酒酵母中，其表達量分別為每毫升培養(yǎng)基25μg和2μg。Kim-SunJung等1997年在小鼠中得到人乳鐵蛋白，表達量可達2.5～200μg/ml，而且可限定在乳腺上皮細胞中表達。2000年他們改進了轉(zhuǎn)基因的結(jié)構(gòu)，由10kb的牛β- 酪蛋白基因(啟動子)和30kb的人乳鐵蛋白基因組成， 使人乳鐵蛋白的表達量提高到60 ～ 6 600μg/ml。牛asl-酪蛋白啟動子也能促進人乳鐵蛋白cDNA的低水平的表達。1990年，美國GerPharm InternationaI公司用酪蛋白啟動子和hLFcDNA構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因，獲得了世界上第一頭帶有人轉(zhuǎn)乳鐵蛋白基因的公牛，它與非轉(zhuǎn)基因母牛交配產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因母牛乳汁中含有人乳鐵蛋白。北京市三元食品有限公司將篩選出的人LF基因部分序列，亞克隆到畢赤氏酵母高效誘導(dǎo)表達質(zhì)粒中，選高產(chǎn)菌株作為多拷貝轉(zhuǎn)化子，采用高密度菌體誘導(dǎo)培養(yǎng)發(fā)酵工藝，使重組人LF的表達量達到625mg/l的高產(chǎn)水平。
4 乳鐵蛋白的應(yīng)用前景
4.1 乳鐵蛋白在乳、食品中的應(yīng)用
LF因其具有多種生理活性功能，在乳品、食品、已得到廣泛應(yīng)用，其開發(fā)前景不可限量。
4.1.1 作為一種高效補鐵食品添加劑，以改變嬰幼兒及孕婦普遍缺鐵的現(xiàn)狀，也可制成含鐵飲料或補鐵膠囊，用來提高造血功能，改善貧血。
4.1.2 作為一種免疫調(diào)節(jié)制劑，在食品或乳制品(如嬰幼兒奶粉)甚至口香糖中，添加LF可調(diào)節(jié)免疫功能。
4.1.3 作為一種助消化劑，國外在乳制品中補充益生菌和LF，制成片劑或速溶飲料，作為運動員的營養(yǎng)品。把LF添加到碳酸飲料、焙烤食品中既具營養(yǎng)價值，又可增進消化功能。
4.1.4 作為一種抗氧化劑，在玉米油乳化體系及卵磷脂脂質(zhì)體系中LF具有抗氧化功能。試驗證明，LF可改進大豆油粉末的保質(zhì)期。
4.1.5 作為一種天然防腐劑，國外已將其添加到乳品、嬰幼兒食品、大豆蛋白制品、肉品中，以控制大腸桿菌、腸炎沙門氏菌等病原微生物。
4.2 乳鐵蛋白作為飼料添加劑的應(yīng)用前景
由于LF和Lfcin的營養(yǎng)生理調(diào)節(jié)作用，它們作為潛在的飼用抗生素替代品為飼料添加劑開發(fā)具有較為廣闊的前景。美國G1anbia公司生產(chǎn)的乳鐵生物蛋白是“運用先進的色譜法和順流加工方法”從乳清中分離而成，含蛋白質(zhì)(94±2)％，LF占總蛋白的(96±3)％，鐵含量15～35mg/100g蛋白，該產(chǎn)品已進入中國市場。在動物生產(chǎn)中使用乳鐵蛋白和乳鐵蛋白活性肽,可降低仔豬的缺鐵性貧血發(fā)病率、提高幼齡動物的免疫機能和動物腸道微生態(tài)環(huán)境,改善動物的健康。美國G1anbia公司報道在仔豬開食料添加0.5%的乳鐵蛋白，提高仔豬的抗病能力。另據(jù)報道在犢牛的日糧中添加乳鐵蛋白，可提高犢牛的造血功能（趙花其，1998）。在我國有生產(chǎn)利用乳鐵蛋白的基礎(chǔ)，生產(chǎn)乳鐵蛋白的原料(初乳)廉價、豐富，而且隨著色譜法和超濾法的更為廣泛深入的研究，可望實現(xiàn)乳鐵蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)。由于乳鐵蛋白和乳鐵蛋白活性肽均為動物初乳中的天然蛋白質(zhì),因此必將為綠色畜牧業(yè)發(fā)揮其應(yīng)有的作用。
參考文獻:(略)
