摘 要：大量的研究表明鈣蛋白酶在蛋白質(zhì)降解方面起著重要作用，為了提高骨骼肌的生長(zhǎng)速度和家畜宰后的肉品質(zhì)，人們對(duì)鈣蛋白酶系統(tǒng)的作用機(jī)理進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶系統(tǒng)中的多種鈣蛋白酶與骨骼肌生長(zhǎng)及宰后嫩化有很大的相關(guān)性。本文就鈣蛋白酶在骨骼肌生長(zhǎng)及其嫩化中的作用的研究作一概述。
關(guān)鍵詞：鈣蛋白酶；骨骼肌；生長(zhǎng)；嫩化
骨骼肌生長(zhǎng)速度最終取決于骨骼肌細(xì)胞的數(shù)量、肌肉蛋白合成速度和降解速度。激素注射、飼料添加劑的使用、營(yíng)養(yǎng)狀況和飼養(yǎng)管理等都能通過(guò)調(diào)節(jié)以上3個(gè)基本因素中的1、2個(gè)或3個(gè)而影響整體蛋白質(zhì)的沉積速度，從而影響肌肉生長(zhǎng)速度。骨骼肌蛋白降解速度相對(duì)降低或蛋白合成速度相對(duì)升高都會(huì)導(dǎo)致肌肉生長(zhǎng)速度的增加，也會(huì)提高攝入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的肌肉轉(zhuǎn)化率。依賴鈣的鈣蛋白酶途徑是骨骼肌蛋白降解的一種非常重要的途徑。肌原纖維蛋白質(zhì)降解的第1步是肌原纖維解裝配成肌絲，這一步可能是肌原纖維蛋白質(zhì)降解過(guò)程中限速的一步。大量的研究表明鈣蛋白酶系統(tǒng)參與這一解裝配過(guò)程。近年的研究表明，calpain是細(xì)胞質(zhì)中主要的蛋白水解酶，在肌原纖維蛋白降解中起著重要作用。肌肉增長(zhǎng)和宰后嫩度的變化與蛋白質(zhì)水解程度密切相關(guān)。因此鈣蛋白酶的活性會(huì)影響畜禽肌肉增長(zhǎng)和肉的嫩度，并對(duì)肉質(zhì)產(chǎn)生一定的影響。
1 鈣蛋白酶的結(jié)構(gòu)
1.1 鈣蛋白酶的結(jié)構(gòu)
鈣蛋白酶（EC3，4，22，17）是細(xì)胞內(nèi)依鈣中性半胱氨酸內(nèi)肽酶。在體內(nèi)，通過(guò)Ca2+激活及自溶而表現(xiàn)出蛋白水解酶的活性，并通過(guò)鈣蛋白酶抑制活化的鈣蛋白酶活性。鈣蛋白酶系統(tǒng)的主要作用對(duì)象是細(xì)胞骨架蛋白、蛋白激酶和磷酸酶以及激素受體。廣泛存在的鈣蛋白酶有鈣蛋白酶1（u-calpain）、鈣蛋白酶2（m-calpain），還有鈣蛋白酶3（p94）。前兩者都由2個(gè)亞基組成，分子量相近，但兩者表現(xiàn)最高活性所需的Ca2+濃度不同。u-calpain所需的Ca2+為1～12umoL/L，而m-calpain所需的鈣離子為250～750u moL/L。它們的小亞基相同，而大亞基是兩個(gè)相關(guān)基因的產(chǎn)物，兩種大亞基之間存在一定的免疫交叉反應(yīng)。有功能的鈣蛋白酶是由大亞基（催化區(qū)，80kd）和小亞基（調(diào)節(jié)區(qū)，30kd）組成，小亞基是單個(gè)基因的產(chǎn)物，而大亞基則是不同基因的產(chǎn)物。不同來(lái)源的鈣蛋白酶cDNA序列發(fā)現(xiàn)其大亞基由4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，其中結(jié)構(gòu)域Ⅱ是表現(xiàn)水解活性的關(guān)鍵部位，它約占大亞基氨基酸殘基數(shù)的35％左右；結(jié)構(gòu)域Ⅳ，位于羧基端，占氨基酸殘基數(shù)的20％，是鈣離子結(jié)合部位；結(jié)構(gòu)域I和結(jié)構(gòu)域Ⅲ分別占氨基酸殘基的10％和35％，可能起活性調(diào)節(jié)作用。calpain3（p94）也是一個(gè)與肌肉的嫩度密切相關(guān)的蛋白酶（圖1）。
圖1 calpain1、calpain2和calpain3的結(jié)構(gòu)示意圖
2 鈣蛋白酶的活性調(diào)節(jié)
2.1 鈣蛋白酶活性的激活調(diào)節(jié)
細(xì)胞中鈣蛋白酶活性受到Ca2+和鈣蛋白酶抑制蛋白（calpastatin）、鈣蛋白酶激活蛋白（calpain activator）的調(diào)節(jié)，其中calpain activator是calpain的正調(diào)節(jié)因子。提高Ca2+濃度，鈣蛋白酶的活性增強(qiáng)，Ca2+濃度進(jìn)一步提高將導(dǎo)致構(gòu)象變化而表現(xiàn)蛋白水解酶活性。當(dāng)鈣蛋白酶被Ca2+激活后，如果附近有鈣蛋白酶抑制蛋白存在，將迅速與之結(jié)合，抑制蛋白酶活性，從而保證鈣蛋白酶對(duì)底物只進(jìn)行局部的特定位點(diǎn)的水解。由于激活鈣蛋白酶所需的Ca2+濃度大于1umol/L，而胞內(nèi)的Ca2+濃度為0.2～0.8umol/L，不足以激活鈣蛋白酶。在活體中，鈣蛋白酶如何被激活一直是一個(gè)令人困惑的問(wèn)題。目前發(fā)現(xiàn)的鈣蛋白酶激活蛋白有2種，一種是UK114，另一種是ACBP-酰基輔酶A結(jié)合蛋白，前者是calpain1的激活因子，后者是calpain2的激活因子。目前牛羊的UK114的cDNA序列已經(jīng)得到克隆。calpain是鈣依賴蛋白酶，只有在Ca2+激活的狀態(tài)下才具有活性，當(dāng)calpain的大小亞基相結(jié)合時(shí)，它不具有活性。在表現(xiàn)水解活性時(shí)，大致發(fā)生以下4個(gè)過(guò)程的變化：calpain大小亞基的分離；小亞基的自溶，30kd亞基迅速降解為17kd；大亞基自溶，80kd轉(zhuǎn)化成78kd再變成76kd；calpain構(gòu)象發(fā)生變化而表現(xiàn)蛋白水解酶活性；calpain受激活后呈自溶狀態(tài)，從而表現(xiàn)活性。calpain受濃度調(diào)控，高Ca2+濃度能加速calpain的活化。除了Ca2+濃度，calpain的活性還受離子強(qiáng)度、pH、底物等因素的影響。
2.2 鈣蛋白酶抑制蛋白的抑制調(diào)節(jié)
calpastatin是高效的、專一的calpain活性抑制劑，并且在大多數(shù)組織中，calpastain的濃度可抑制calpain的活性。當(dāng)calpain被Ca2+ 激活，如果附近有calpastatin存在，將迅速與之結(jié)合，影響u-calpain的自溶穩(wěn)定性，抑制calpain活性，從而保證calpain對(duì)底物只進(jìn)行局部的特定位點(diǎn)的水解（Roman等，1999）。鈣蛋白酶抑制蛋白與鈣蛋白酶結(jié)合后，降低calpain的活性，可能起到防止鈣蛋白酶被隨機(jī)激活的作用。一些抑制劑可以以共價(jià)鍵的方式與酶的巰基牢固結(jié)合，使酶失去活性，如碘乙酰胺、碘乙酸、E-64等可對(duì)calpain發(fā)生不可逆抑制作用。根據(jù)這些特性，人工合成一些多肽以抑制calpain的活性，如leupeptin、三肽氯甲基酮，它們?cè)赑2位點(diǎn)都含有亮氨酸，對(duì)calpain發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)抑制作用。
3 鈣蛋白酶在骨骼肌生長(zhǎng)中的作用
骨骼肌鈣蛋白酶存在于肌細(xì)胞內(nèi)部，在Z線中濃度最高。快速萎縮肌肉中鈣蛋白酶活性是正常肌肉的數(shù)倍，它的一個(gè)特征是Z線的降解，而肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白保持完整。肌原纖維蛋白質(zhì)降解的第1步必須是肌原纖維解裝配成肌絲。大量研究表明，鈣蛋白酶系統(tǒng)參與這一解裝配過(guò)程。鈣蛋白酶引發(fā)肌原纖維蛋白質(zhì)降解的可能機(jī)制如下：鈣蛋白酶使Z線（使細(xì)肌絲固著于肌原纖維）和肌聯(lián)蛋白、伴肌動(dòng)蛋白（使粗肌絲和細(xì)肌絲固著于肌原纖維）降解，肌原纖維釋放出肌絲。細(xì)肌絲的肌原蛋白和原肌球蛋白以及粗肌絲的C-蛋白降解，粗肌絲和細(xì)肌絲分別解離出肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白，釋放出的粗肌絲和細(xì)肌絲可與母體或其他肌原纖維重新裝配，也可被胞質(zhì)蛋白酶或溶酶體組織蛋白酶降解成氨基酸。肌原纖維的殘留部分功能完整，收縮力量減弱。
研究表明，calpain的作用可能僅在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用，而并非整個(gè)降解過(guò)程的直接參與者。推測(cè)calpain可能通過(guò)對(duì)肌原纖維蛋白進(jìn)行特異的局部降解而對(duì)其結(jié)構(gòu)、功能進(jìn)行調(diào)控。calpain導(dǎo)致肌肉降解可分為兩步：首先攻擊肌原纖維的肌節(jié)（兩個(gè)相鄰Z盤(pán)之間的一段肌原纖維）部位，釋放肌絲降解為小片段，然后被溶酶體所捕獲進(jìn)一步降解。calpain主要集中于Z盤(pán)，因此認(rèn)為，降解從此處開(kāi)始。但近期研究發(fā)現(xiàn)，calpain首先水解的是N2線。calpain參與骨架蛋白的降解是蛋白質(zhì)水解過(guò)程中的限速步驟。楊曉靜等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)豬注射重組生長(zhǎng)激素后，背最長(zhǎng)肌calpain3mRNA的表達(dá)有上升趨勢(shì)，半腱肌中calpain3mRNA的相對(duì)豐度顯著上升，在肌肉增長(zhǎng)的過(guò)程中calpain3也可能參與蛋白的降解。
4 鈣蛋白酶在肌肉嫩化中的作用
肉的嫩度主要決定于肌纖維、肌節(jié)長(zhǎng)度、肌內(nèi)脂肪和結(jié)締組織等。哺乳動(dòng)物肌纖維在胚胎形成過(guò)程中受到MyoD家族的調(diào)控，MyoD家族包括MyoDI、肌細(xì)胞生成素（myogenin，MYOD）、myf-5和myf-6，它們通過(guò)調(diào)節(jié)肌肉分化階段特異性蛋白的表達(dá)來(lái)參與肌細(xì)胞的分化。MyoD基因控制啟動(dòng)成肌細(xì)胞融合和肌纖維形成，在肌肉分化過(guò)程中起關(guān)鍵作用。Esson Gustavsson(1993)研究發(fā)現(xiàn)肌纖維的數(shù)量在出生時(shí)就決定了，生后肌纖維生長(zhǎng)只限于肌纖維長(zhǎng)度和橫切面積的增長(zhǎng)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)肌肉品質(zhì)受到肌纖維類型和直徑的影響，用肌球蛋白ATP酶可將肌纖維分為3種類型，即1、IIA和IIB型。紅肌（即I型纖維）較白肌(即Ⅱ型纖維)的纖維含量多、肌纖維細(xì)、肌肉較嫩。肌原纖維的狀態(tài)對(duì)嫩度具有決定性的作用，肌原纖維越碎裂、越舒張，剪切力越低、嫩度越好（陳代文等，2001）。嫩化是尸僵發(fā)生后一定時(shí)間內(nèi)，肌纖維碎裂，肌肉重新變軟，嫩度增加的過(guò)程。鈣蛋白酶系統(tǒng)在細(xì)胞內(nèi)參與機(jī)體生長(zhǎng)與代謝過(guò)程，還在肌原纖維更新和宰后嫩化中扮演重要角色。calpain表達(dá)減少以及calpastatin表達(dá)量的增加，都會(huì)導(dǎo)致肌肉蛋白水解率及宰后肉嫩度的下降，這表明calpain水解作用是導(dǎo)致肉嫩化的主要因素。在宰后嫩化的過(guò)程中m-calpain的活性幾乎不變，而u-calpain的活性顯著下降，鈣蛋白酶活性下降是其發(fā)揮水解作用的體現(xiàn)。由于活體宰后Ca2+濃度可以激活u-calpain而不能激活m-calpain，大量研究表明在肌肉的熟化過(guò)程中u-calpain的活性增高，含量急劇下降，因此u-calpam被認(rèn)為是改善肉質(zhì)嫩度的候選基因。Morgan等（1993）和Koohmaraie等（1996）認(rèn)為u-calpain是肉嫩化的基本酶類。Ilian等（2001）研究發(fā)現(xiàn)肉的嫩度與u-calpain的活性具有相關(guān)性。calpastatin可抑制鈣蛋白酶的活性，降低蛋白質(zhì)水解，但鈣蛋白酶系統(tǒng)調(diào)節(jié)肌肉嫩化的具體機(jī)制還不甚清楚。
5 結(jié)論
家畜整體蛋白質(zhì)的增加受兩個(gè)過(guò)程制約：整體蛋白質(zhì)合成和降解，控制蛋白質(zhì)降解和合成可以提高肌肉生長(zhǎng)速度。許多研究表明，calpain在肌原纖維蛋白的降解，特別是在早期肌肉轉(zhuǎn)化過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，抑制其活性有可能抑制蛋白質(zhì)的降解從而提高肌肉生長(zhǎng)。但是現(xiàn)有的抑制劑除抑制calpain的活性外還或多或少地抑制其他蛋白酶的活性，缺乏專一性。而calpastatin是高效的、十分專一的calpain活性抑制蛋白，因此可以通過(guò)基因調(diào)控技術(shù)提高其在肌肉組織中的表達(dá)來(lái)抑制calpain的活性，從而達(dá)到提高肌肉生長(zhǎng)的目的。我們可以重組DNA技術(shù)超表達(dá)鈣蛋白酶抑制蛋白或有缺陷的鈣蛋白酶，然后研制細(xì)胞系，鈣蛋白酶抑制蛋白或鈣蛋白酶的超表達(dá)均可能在其中被肌肉特異啟動(dòng)子啟動(dòng)，從而控制肌原纖維蛋白質(zhì)降解以加快蛋白質(zhì)積累。肉的嫩化與calpain的活性有關(guān)，因此可以通過(guò)激活calpain或降低calpastadn活性的方式提高肉的嫩度，改善肉質(zhì)，也就是說(shuō)可以在家畜生長(zhǎng)階段提高calpastadn的活性來(lái)抑制calpain的活性，促進(jìn)蛋白質(zhì)的沉積，提高骨骼肌的生長(zhǎng)速度，在屠宰前提高calpain的活性以增加骨骼肌的嫩度。但總的來(lái)說(shuō)鈣蛋白酶系統(tǒng)的具體調(diào)控機(jī)理還不很清楚，還需要利用分子生物學(xué)等技術(shù)手段進(jìn)行深入的研究。
（參考文獻(xiàn)略）
